本發(fā)明涉及免疫，尤其涉及人偏肺病毒單克隆抗體及其應用。

背景技術：

1、人偏肺病毒（hmpv，human?metapneumovirus）是2001年由荷蘭的研究小組首次分離的單股負義rna病毒，被分類為副粘病毒科、肺病毒亞科、偏肺病毒屬。hmpv根據(jù)血清學特征被分類為a和b這兩種基因型，進一步又被分類為a1、a2、b1、b2四個亞型，其中，a2株成為近來世界范圍內(nèi)流行的主流毒株。hmpv傳播具有季節(jié)性，常見發(fā)病于早春和冬季。hmpv被認為是嬰兒呼吸道感染的主要原因，兒童在5歲時幾乎普遍接觸病原體。盡管hmpv感染大多表現(xiàn)為自限性疾病，但免疫功能受損和老年人可進展為重癥肺炎以及細支氣管炎，出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征或多器官功能不全等，甚至導致死亡。此外，hmpv被認為是sars冠狀病毒引起的嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥亞群的共同病原體，也是致命性腦炎發(fā)病的病原體。

2、hmpv?編碼三種表面糖蛋白：附著（g）、小疏水（sh）和融合（f）糖蛋白。f糖蛋白促進病毒包膜與宿主細胞膜的融合，從而介導病毒rna進入靶細胞細胞質(zhì)。因此，hmpv?f蛋白被認為是產(chǎn)生有效中和和預防hmpv感染的主要抗原決定簇。由于rsv和hmpv疫苗的研發(fā)在病毒特性、免疫機制和技術路線上高度相關，一些rsv疫苗的經(jīng)驗可為hmpv疫苗研發(fā)提供重要參考，推動hmpv疫苗的進展。目前rsv部分亞單位疫苗已進入臨床試驗階段。針對f蛋白三聚體設計的亞單位疫苗誘導所產(chǎn)生的單克隆抗體可以阻斷病毒與宿主細胞的融合，從而抑制病毒的復制和傳播。f蛋白具有的融合前（pre）和融合后（post）兩種構(gòu)象都具有產(chǎn)生中和抗體的能力，但pre-f蛋白相對于post-f蛋白誘導產(chǎn)生更強的免疫保護作用，因此常被視為疫苗設計和抗病毒藥物開發(fā)的潛在靶點。

3、人偏肺病毒亞單位實驗性疫苗原液純度是疫苗安全性和有效性的關鍵。在f蛋白的表達、純化和濃縮過程中，可能因其環(huán)境條件、化學試劑、氧化和修飾以及純化方法等原因發(fā)生可能的構(gòu)象變化，部分pre-f轉(zhuǎn)換為post-f,所以確定pre-f的蛋白純度和有效比例，在該實驗性疫苗的研究制備過程中至關重要。更高純度的pre-f蛋白作為有效抗原對于開發(fā)hmpv疫苗和治療策略優(yōu)化具有重要意義。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供人偏肺病毒單克隆抗體及其應用，本發(fā)明為hmpv亞單位疫苗開發(fā)的原液的純度鑒別提供了更具精確、更新穎的檢測抗體，并為hmpv的診斷和治療及其候選靶標的篩選提供可行策略。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：

3、本發(fā)明提供了一種單克隆抗體f720-1，所述單克隆抗體f720-1重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別如seq?id?no.1的第26-33、51-58、97-107位氨基酸序列所示；

4、所述單克隆抗體f720-1輕鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別如seqid?no.3的第27-36、54-56、93-100位氨基酸序列所示。

5、本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體f720-1的編碼基因，包含如seq?id?no.5所示的720-1h核苷酸序列和如seq?id?no.7所示的720-1l核苷酸序列。

6、本發(fā)明還提供了一種單克隆抗體f390-6，所述單克隆抗體f390-6重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別如seq?id?no.2的第26-33、51-58、97-107位氨基酸序列所示；

7、所述單克隆抗體f390-6輕鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別如seqid?no.4的第27-36、54-56、93-100位氨基酸序列所示。

8、本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體f390-6的編碼基因，包含如seq?id?no.6所示的390-6h核苷酸序列和如seq?id?no.8所示的390-6l核苷酸序列。

9、本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體f720-1、單克隆抗體f390-6或者編碼基因在制備檢測人偏肺病毒的試劑或試劑盒中的應用。

10、本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體f720-1、單克隆抗體f390-6或者編碼基因在制備人偏肺病毒疫苗中的應用。

11、本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體f720-1、單克隆抗體f390-6或者編碼基因在評價人偏肺病毒亞單位疫苗純度中的應用。

12、本發(fā)明還提供了一種評價人偏肺病毒疫苗純度的方法，包括以下步驟：

13、將本發(fā)明提供的上述單克隆抗體f390-6包被至酶標板，封閉非特異性結(jié)合位點；

14、加入待測樣品，孵育結(jié)合；

15、加入生物素標記的本發(fā)明提供的上述單克隆抗體f720-1，孵育；

16、進行酶促信號放大與顯色處理，讀取od值，得到檢測數(shù)據(jù)；

17、通過pre-f標準品建立比例標準曲線計算樣品中pre-f占總f蛋白比例或絕對濃度，以評價人偏肺病毒亞單位疫苗純度。

18、本發(fā)明還提供了一種人偏肺病毒融合前構(gòu)象f蛋白檢測定量檢測試劑盒，含有單克隆抗體f720-1和單克隆抗體f390-6。

19、本發(fā)明還提供了一種人偏肺病毒疫苗純度檢測試劑盒，含有單克隆抗體f720-1和單克隆抗體f390-6。

20、本發(fā)明的有益效果：

21、本發(fā)明通過雜交瘤技術篩選并制備出了兩種針對人偏肺病毒f蛋白的單克隆抗體（命名為f720-1、f390-6），其中單克隆抗體f720-1僅對人偏肺病毒融合前構(gòu)象f蛋白（pre-f）具有結(jié)合活性，其中所述單克隆抗體f390-6對人偏肺病毒融合前構(gòu)象f蛋白（pre-f）以及人偏肺病毒融合后構(gòu)象f蛋白（post-f）均具有結(jié)合活性。進一步，通過配對確定了f720-1和f390-6可以通過酶聯(lián)免疫吸附雙抗夾心法對人偏肺病毒f蛋白中pre-f和post-f進行比例檢測。進一步，通過配對確定了f720-1和f390-6可以通過酶聯(lián)免疫吸附雙抗夾心法對pre-f進行定量。本發(fā)明公開了f720-1和f390-6的序列以及酶聯(lián)免疫吸附雙抗夾心法檢測重組人偏肺病毒疫苗原液中f蛋白pre-f占比測定的方法。

22、本發(fā)明構(gòu)建穩(wěn)定表達融合前構(gòu)象f蛋白的質(zhì)粒，搭配不同的免疫佐劑提高蛋白的免疫原性，能夠克服原有pre-f蛋白免疫后血清效價低的問題，有望用于人偏肺病毒疫苗評價。

23、本發(fā)明的兩個單克隆抗體都對人偏肺病毒pre-f蛋白具有良好的結(jié)合活性，本發(fā)明所提供的f720-1與pre-f結(jié)合的ec50值為0.018μg/ml。本發(fā)明提供的f390-6與pre-f的結(jié)合ec50值為0.016μg/ml。本發(fā)明提供的f720-1結(jié)合的ec50對post-f值為14.98μg/ml，本發(fā)明提供的f390-6與post-f的結(jié)合ec50值為0.01449μg/ml。

24、本發(fā)明所述的用于檢測人偏肺病毒融合蛋白pre-f和post-f占比，具有良好線形關系及擬合度，r2=0.9985。

25、本發(fā)明所述的用于檢測人偏肺病毒pre-f蛋白最低檢出濃度為0.49?ng/ml，定量范圍在3.91ng/ml至62.5ng/ml的劑量范圍內(nèi)具有線性關系。