本申請(qǐng)涉及蛋白質(zhì)純化，具體涉及一種天然血紅蛋白a2的純化方法。
背景技術(shù)：
1、地中海貧血（簡(jiǎn)稱“地貧”）是一組由于珠蛋白基因(地貧基因)缺陷使血紅蛋白中珠蛋白肽鏈合成障礙所致的遺傳性溶血性疾病。地中海貧血患者通常會(huì)出現(xiàn)貧血，因?yàn)樯眢w無(wú)法制造足夠的血紅蛋白。血紅蛋白是一種幫助紅細(xì)胞攜帶氧氣的蛋白質(zhì)，如果沒(méi)有足夠的血紅蛋白，血液中的紅細(xì)胞就無(wú)法正常工作，無(wú)法有效地將氧氣輸送到全身的細(xì)胞，進(jìn)而引起組織器官缺氧，從而使人感到疲倦。
2、成人的血紅蛋白（hb）通常由血紅蛋白a（hba，97％左右）和血紅蛋白a2（hba2，3％左右）組成。hba又可分為非糖化血紅蛋白，即天然血紅蛋白hba0，和糖化血紅蛋白hba1。血紅蛋白a2由2個(gè)α珠蛋白和2個(gè)δ珠蛋白組成，其升高是β地中海貧血患者的特征性指標(biāo)，正常人群hba2水平在2.2%-3.3%范圍內(nèi)，典型的β地中海貧血基因攜帶者其hba2水平在4.0%-6.0%范圍。
3、傳統(tǒng)的hba2檢測(cè)方法常受樣本中雜蛋白，如hba1的干擾，準(zhǔn)確性欠佳。在復(fù)雜的血液成分里，hba2與其他血紅蛋白(hba0、hba1)共存，分離純化難度高。以往的純化手段，諸如色譜柱分離、離子柱層析等，難以徹底去除結(jié)構(gòu)相近的干擾成分，致使后續(xù)定量分析誤差較大。而且，部分分離方法易造成目標(biāo)蛋白變性失活，影響對(duì)其天然特性及功能的深入研究。此外，現(xiàn)有技術(shù)操作繁瑣、耗時(shí)久，不適用于臨床大量樣本快速處理需求。鑒于此，開(kāi)發(fā)一種高效、能保留天然活性的hba2純化方法迫在眉睫。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N天然血紅蛋白a2的純化方法，先通過(guò)硼酸柱去除糖化血紅蛋白hba1，再通過(guò)抗體與血紅蛋白a中的β鏈的特異性結(jié)合，生成多聚體復(fù)合物，進(jìn)而使得可以通過(guò)離心的方式將血紅蛋白a和血紅蛋白a2分離，進(jìn)而制得純化的hba2凍干品。本申請(qǐng)?zhí)峁┑奶烊谎t蛋白a2的純化方法簡(jiǎn)單高效，純化出的天然血紅蛋白a2純度高，可用于擴(kuò)大生產(chǎn)，有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。
2、為達(dá)到上述目的，本申請(qǐng)采用包括如下步驟的技術(shù)方案：
3、紅細(xì)胞的破碎及提?。?/p>
4、過(guò)硼酸柱，得到富集hba0和hba2的混合液；
5、抗體與hba0的β鏈特異性結(jié)合，形成多聚體復(fù)合物；
6、離心分離多聚體復(fù)合物和hba2，得到純化的hba2；
7、制備hba2凍干品。
8、有益的技術(shù)效果：
9、通過(guò)硼酸柱上的硼酸基團(tuán)，與糖化血紅蛋白hba1上的順式二醇基團(tuán)形成共價(jià)復(fù)合物，從而使天然血紅蛋白中的糖化血紅蛋白hba1被硼酸柱靶向捕獲，達(dá)到分離hba1并富集hba0和hba2的效果，避免了hba1對(duì)后續(xù)hba2純化過(guò)程的干擾，顯著降低后續(xù)抗體處理以及進(jìn)一步純化時(shí)的樣品復(fù)雜度。
10、而富集后的hba0和hba2的混合液可以經(jīng)過(guò)稍過(guò)量的血紅蛋白β多克隆抗體或血紅蛋白β單克隆抗體的處理，使得hba0與所述抗體特異性結(jié)合，形成分子量明顯大于hba2的多聚體復(fù)合物；同時(shí)所述抗體的分子量也高過(guò)hba2，從而可以通過(guò)離心的方式將多聚體復(fù)合物以及過(guò)量的抗體與hba2高效地分離。且該方法制得的hba2純度高，易于放大生產(chǎn)，適合hba2制劑的規(guī)?；苽?。
1.一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述紅細(xì)胞的破碎及提取的過(guò)程包括：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述全血與pbs緩沖液的質(zhì)量比為1:3；所述全血與純水的質(zhì)量比為1:3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述過(guò)硼酸柱，得到富集hba0和hba2的混合液的過(guò)程包括：
5.?根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述含有50mm??；撬?naoh、20mm?mgcl2的平衡緩沖液ph值為8.5～8.9。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述抗體與hba0的β鏈特異性結(jié)合，形成多聚體復(fù)合物的過(guò)程包括：
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述抗體包括血紅蛋白β多克隆抗體和血紅蛋白β單克隆抗體中的任意一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述抗體與富集hba0和hba2的混合液的質(zhì)量比為（1.2~1.5）：1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述離心分離多聚體復(fù)合物和hba2，得到富集純化的hba2的過(guò)程包括：
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述制備hba2凍干品的過(guò)程包括：