本發(fā)明涉及分子育種，尤其涉及一種rcwrky29基因及其在增強(qiáng)月季(rosa?hybrida)對(duì)灰霉病抗性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、月季（rosa?hybrida）是薔薇科（rosaceae）薔薇屬（rosa）多年生常綠或者半常綠木本觀賞植物。月季兼具花型端莊、花色艷麗、花香馥郁等特點(diǎn)，有很高的觀賞、經(jīng)濟(jì)和文化價(jià)值，位居世界四大切花之首，廣泛應(yīng)用于園林綠化、庭院裝飾、盆花、香料和化妝品工業(yè)等方面。
2、切花月季是四大切花之一，灰霉病是月季鮮切花采后運(yùn)輸過程中面臨的危害最大的真菌性病害，嚴(yán)重?fù)p害了切花月季的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，月季切花在長(zhǎng)途物流運(yùn)輸?shù)倪^程中極易受到灰霉病的侵害，約?15-40%的月季由于采后腐敗而完全喪失經(jīng)濟(jì)價(jià)值?；瘜W(xué)防治、物理防治、生物防治和農(nóng)業(yè)防治都存在一定的弊端。因此，從根本上防治月季灰霉病應(yīng)該從月季抗灰霉病遺傳育種入手。通過研究月季和灰霉病的相互作用，挖掘和培育高抗月季新品種，減少月季切花產(chǎn)業(yè)因?yàn)榛颐共‘a(chǎn)生經(jīng)濟(jì)損失。目前，針對(duì)rcwrky29基因在月季抗灰霉病中的具體作用機(jī)制尚不明確，因此有必要通過基因編輯或轉(zhuǎn)基因技術(shù)來研究其功能。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明的目的是提供一種rcwrky29基因及其在增強(qiáng)月季(rosa?hybrida)對(duì)灰霉病抗性中的應(yīng)用。通過該基因的過表達(dá)來增強(qiáng)月季對(duì)灰霉病的抗性，培育高抗月季新品種。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
3、本申請(qǐng)第一方面提供一種rcwrky29基因或其轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白表達(dá)的產(chǎn)品在增強(qiáng)月季抵抗灰霉病的應(yīng)用，rcwrky29基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
4、本申請(qǐng)第二方面提供一種增強(qiáng)月季抵抗灰霉病的方法，其特征在于包括如下步驟：（1）構(gòu)建包含權(quán)利要求1所述 rcwrky29基因的重組載體；
5、（2）?將所述重組載體導(dǎo)入月季細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn) rcwrky29基因的過表達(dá)。
6、進(jìn)一步地，在步驟（1）中，載體引物設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建：以ecori和kpni為酶切位點(diǎn)，將 rcwrky29的沉默片段序列插入trv2空載中，利用同源重組的方法設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建trv- ? rcwrky29載體，所述 rcwrky29基因的沉默片段的核苷酸序列如seq?id?no:?3所示。
7、進(jìn)一步地，在步驟（2）中，選取smai和kpni為酶切位點(diǎn)，將 rcwrky29基因序列插入psuper-1300載體中，利用同源重組的方法設(shè)計(jì)引物，以構(gòu)建 rcwrky29-gfp載體，重組載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入月季細(xì)胞。
8、有益效果：本發(fā)明從月季品種‘月月粉’基因組中鑒定出一個(gè)抗病調(diào)節(jié)基因rcwrky29，發(fā)現(xiàn)該基因在月季花瓣組織中高表達(dá)，在根和葉等組織中表達(dá)量低。在灰霉病菌侵染月季花朵不同時(shí)間中rcwrky29的表達(dá)情況分析中，發(fā)現(xiàn)rcwrky29的表達(dá)在灰霉侵染后一定時(shí)間段里有明顯升高。因此本申請(qǐng)推測(cè)rcwrky29可能參與調(diào)節(jié)月季對(duì)灰霉病的抵抗作用。
9、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
10、（1）本發(fā)明中根據(jù)rcwrky29在月季花瓣中的表達(dá)結(jié)果，瞬時(shí)沉默和過表達(dá)花瓣中的rcwrky29，發(fā)現(xiàn)rcwrky29的異常表達(dá)會(huì)影響月季花瓣對(duì)灰霉病的抗性，過表達(dá)rcwrky29能促進(jìn)花瓣對(duì)灰霉病的抵抗，反之，沉默則會(huì)抑制花瓣對(duì)灰霉病的抵抗。
11、（2）本發(fā)明在月季生長(zhǎng)狀態(tài)良好、無灰霉病菌侵染的花瓣中沉默以及過表達(dá)rcwrky29基因，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默rcwrky29處理的花瓣病斑面積更大，對(duì)灰霉病的抗性降低；過表達(dá)rcwrky29處理的花瓣對(duì)灰霉病的抗性增強(qiáng)，總之，rcwrky29對(duì)調(diào)節(jié)月季抗灰霉病具有重要意義。
1.一種rcwrky29基因或其轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白表達(dá)的產(chǎn)品在增強(qiáng)月季抵抗灰霉病的應(yīng)用，其特征在于：rcwrky29基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.一種增強(qiáng)月季抵抗灰霉病的方法，其特征在于包括如下步驟：（1）構(gòu)建包含權(quán)利要求1所述rcwrky29基因的重組載體；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：在步驟（1）中，載體引物設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建：以ecori和kpni為酶切位點(diǎn)，將rcwrky29的沉默片段序列插入trv2空載中，利用同源重組的方法設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建trv-?rcwrky29載體，所述rcwrky29基因的沉默片段的核苷酸序列如seq?id?no:?3所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：在步驟（2）中，選取smai和kpni為酶切位點(diǎn)，將rcwrky29基因序列插入psuper-1300載體中，利用同源重組的方法設(shè)計(jì)引物，以構(gòu)建rcwrky29-gfp載體，重組載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入月季細(xì)胞。