本發(fā)明涉及一種對多個細胞的靶基因序列進行測序的方法。

背景技術：

1、稀有細胞，例如成人干細胞、循環(huán)腫瘤細胞和反應性免疫細胞(例如對某種抗原有反應性的t細胞、b細胞或nk細胞)，是基礎研究者和轉化研究者非常感興趣的。例如，對某種病原體(例如病毒)發(fā)生反應并且可以產生抗特定病原體的抗體的反應性免疫細胞(諸如b細胞克隆)，對于產生急需的治療性抗體具有重要價值。同樣，反應性t細胞在個性化醫(yī)療和癌癥及其他疾病的治療背景下也受到追捧。一旦鑒定并分離出反應性t細胞，可以克隆編碼相應的t細胞受體的基因序列并用于生成基因工程化的t細胞，諸如car-t細胞，該相應的t細胞受體針對靶抗原表現出親和性。同樣，循環(huán)腫瘤細胞有望在診斷癌癥、預測結局、管理療法以及發(fā)現新的癌癥藥物和基于細胞的療法方面具有重要價值。含有稀有細胞的細胞懸浮液通常通過分離方法從組織樣品或液體活檢中獲得。因此，，對這些樣品中的稀有細胞的鑒定、分析和分離，具體地在單細胞水平上對這些細胞的分析(單細胞分析，sca)，對于基礎研究和轉化研究、診斷和治療應用、以及在生物品和細胞療法的生物過程、開發(fā)和生產都具有重要價值。

2、隨著鑒定和區(qū)分各種細胞類型的能力的擴展，對細胞類型的鑒定也變得更加精細，即感興趣稀有細胞群更小且被更好地定義。因此，為了發(fā)現感興趣稀有細胞，通常需要分析高(<10萬)、非常高(<100萬)或超高(>100萬)數量的細胞。

3、具體地，廣泛關注存在于能夠篩選大量b細胞或t細胞克隆群以找到表現出期望特性的克隆的技術。在許多情況下，在鑒定這種克隆之后，對編碼抗體或tcr的可變部分的相應基因組序列進行克隆和測序。已經開發(fā)各種方法以篩選單細胞或克隆并且用于篩選b細胞/t細胞克隆。這些方法包括在微孔板中進行有限稀釋和人工篩選、納米孔成像方法、光流控系統(tǒng)和其他基于微流控技術和流通型成像(imagingin?flow-through)的方法。

4、雖然這些方法中的一些方法在通量方面固有地非常受限制，但它們全部共同的關鍵限制在于，克隆來自感興趣克隆的基因組序列需要將該克隆與其他克隆物理分離。這意味著，在工作流程中在某個點必須將所有單個細胞/克隆排列到孔、納米孔、納米圍欄(nanopens)等中，或者必須將它們從剩余細胞中分選出來。但是，據估計，理想地，每種所需要的抗體或tcr都將以10萬億個克隆的量級進行篩選，因為這個數量似乎與免疫組庫中存在的實際多樣性是充分相關的。每個項目對10萬億個克隆的分選或排列都是難以承受的過高的勞動強度，這就是為什么目前大多數篩選活動對顯著較少的克隆取樣的原因。

5、因此，期望能夠跟蹤單獨的細胞，并將來自不同分析類型的分析數據分配至大量混合細胞中的特定細胞。

技術實現思路

1、因此，本技術的一個目的在于提供一種能夠以高通量對大量的單個細胞的靶基因序列進行測序的方法。

2、通過獨立權利要求的主題實現了上述目的。在從屬權利要求和以下描述中限定了有利的實施方案。

3、提供了一種對多個細胞的靶基因序列進行測序的方法，其包括以下步驟：提供液滴，每個液滴都包含所述多個細胞中的至少一個細胞和至少一種光學上可檢測的標志物。所述標志物包含：在預定位置具有多個附著位點的核酸骨架；用于附著至至少一些所述附著位點的多個標記物；至少第一取向指示劑和第二取向指示劑；其中每個標記物都包含：至少一種染料，尤其熒光染料；被配置為獨特地編碼所述至少一種染料的特征的編碼寡核苷酸部分；和被配置為可逆地附著至所述附著位點之一的附著寡核苷酸部分；并且每個標記物的所述附著寡核苷酸部分都包含被配置為結合至所述附著位點之一的互補序列的獨特寡核苷酸序列。所述方法還包括步驟：從所述細胞中釋放所述靶基因序列；將所述靶基因序列與所述標志物的所述標記物連接，以生成測序構建體；以及對所述測序構建體進行測序。

4、具體地，在將所述靶基因序列連接至所述標志物的所述標記時，將所述靶基因序列與所述標記物的寡核苷酸連接，具體地，將所述標志物的所述標記物的所述編碼寡核苷酸部分與所述附著寡核苷酸部分連接。因此，所述測序構建體每個都包含：所述靶基因序列中的至少一個基因序列，和所述標志物的所述標記物中的一個標記物的所述編碼寡核苷酸部分及所述附著寡核苷酸部分。

5、在使用結構dna納米技術制備的支架上染料或染料組合的排列可以達到這樣的目的：通過組合編碼，采用有限量的染料可以生成大量的染料組合。然后，所述組合編碼可以與dna納米結構骨架上的空間編碼組合，由此使所述染料或染料組合能夠精確排列在所述骨架上。通過讀取所述標記物和取向指示劑可以光學上讀取這種排列，以及通過讀取/測序附著寡核苷酸部分-編碼寡核苷酸部分的序列區(qū)段(sequence?stretches)，使用dna測序可以光學上讀取這種排列，所述序列區(qū)段將相應染料與相應標志物連接(link)。以這種方式可以生成大量的標志物，所述標志物：(a)允許進行大量液滴的有效顆粒索引(鑒定)，(b)允許對所述索引的光學讀取，(c)允許基于dna測序的所述索引的讀取，和(d)允許將所述索引的一部分或整個索引(可靠地鑒定給定標志物所需要的給定標志物的所有附著寡核苷酸部分-編碼寡核苷酸部分序列區(qū)段的串聯體(concatenate))與感興趣基因靶序列進行物理地連接，由此相繼地(e)能夠對顆粒索引-基因靶序列-融合產物進行測序，其(f)能夠通過對所述串聯體進行測序，可以很容易地檢索到來自感興趣克隆的感興趣基因靶序列。在這種情況下，使用基于成像的篩選和測定，例如抗原結合、抗體聚集、特異性克隆生產率、細胞因子分泌、靶細胞中報告基因的活性、殺傷測定、生長動力學測定等，可以很容易地鑒定感興趣克隆。具體地，由所述標志物提供的顆粒索引允許在成像期間對相同克隆的可信識別以及在時間序列采集或順序測定中從一個時間點到下一時間點的可靠三維取向。以這種方式，可以根據多個相關標準對大量克隆進行認定和排序。該方法還允許可以從這些優(yōu)先的克隆中有效檢索感興趣靶基因序列。在這一點上，可以提供兩種可替代的示例性方法。第一種方法基于將讀取完整索引所需要的序列區(qū)段的部分連接至給定的靶基因序列，以提供所述測序構建體。在這種情況下，通過對足夠數量的連接體(ligates)進行測序，讀取所述完整索引/代碼，以讀取所述完整索引，并且必須在單液滴水平上進行測序。

6、在第二種可替代的示例性方法中，將屬于給定液滴中的給定標志物的所有編碼寡核苷酸部分-附著寡核苷酸部分-序列區(qū)段之間的完整串聯體與所述靶基因序列連接(串聯)在一起，以提供所述測序構建體。

7、這種靶基因序列可以是單個或多個序列。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述靶基因序列編碼抗體或t細胞受體、或其部分(例如編碼框架、可變區(qū)、高變區(qū)、互補決定區(qū)的區(qū)域)。

8、申請?zhí)枮閑p?22153210.4的專利申請中公開了適合的標志物的細節(jié)，其內容通過引用并入本文。

9、所述取向指示劑被配置為附著至所述骨架，并且可以是例如熒光染料。所述取向指示劑可以用于在視覺上確定在空間中所述標志物的取向。所述編碼寡核苷酸部分是核酸的獨特序列，其對于所述標記物的所述至少一種染料的激發(fā)/發(fā)射波長和/或熒光壽命是獨特的。因此，通過每個標記物中染料的獨特組合及其特定的附著位點，可以在視覺上明確地鑒定所述標志物。通過對獨特的編碼寡核苷酸部分和附著寡核苷酸部分進行測序，可以明確地鑒定相同的標志物。

10、通過將所述靶基因序列與所述標記物的寡核苷酸連接，具體地，與所述標志物的所述標記物的所述編碼寡核苷酸部分和所述附著寡核苷酸部分連接，所述靶基因序列與序列信息物理地連接，從而能夠明確地鑒定所述標志物，并因此將所述靶基因序列與所述標志物連接。

11、優(yōu)選地，所述核酸骨架包含支架鏈和訂書釘鏈，所述訂書釘鏈被配置為在預定位置與所述支架鏈結合，以使所述支架鏈折疊成預定形狀。所述骨架可以是dna折紙。這些dna折紙結構的尺寸可以為從幾納米到微米的范圍。為了制造這種基于dna折紙的結構，在被所謂的訂書釘鏈精確鑒定的位置將較長的dna分子(支架鏈)折疊。所述dna折紙可以設計成提供具有特定的預定形狀的自組裝骨架。這使得可實現所述骨架的容易且可重復的合成和組裝。訂書釘鏈可以被位置選擇性地功能化。在這種情況下，位置分辨率受到核苷酸尺寸(在納米或低于納米的范圍內)的限制?，F有技術已經利用這一點生成了熒光標準(fluorescent?standards)，其中熒光染料與所述dna折紙上被精確定位的條帶(bands)連接。這些標準被稱為“納米尺”，并且用于共聚焦顯微鏡或超分辨率顯微鏡(例如sted)等成像系統(tǒng)的校準，例如，如us2014/0057805?a1所公開的。

12、所述dna折紙為所述標記物提供了支架。優(yōu)選地，所述dna折紙結構包含至少一條支架鏈和多條訂書釘鏈，其中所述訂書釘鏈與至少部分的所述支架鏈互補，并被配置為將所述支架鏈變?yōu)轭A定的構象。具體地，所述鏈是寡核苷酸。這能夠生成具有可以自組裝的預定的二維或三維形狀的骨架。此外，這能夠在所述骨架上特異性安置附著位點。

13、所述附著位點優(yōu)選地是所述訂書釘鏈的獨特核酸序列。優(yōu)選地，在預定的附著位點所述標記物可以附著至所述骨架的訂書釘鏈。由于所述訂書釘鏈位于預定位置，因此，所述附著位點的位置同樣也可以預定。因此，所述附著位點(所述核酸骨架的附著位點)是與一個標記物的所述附著寡核苷酸部分互補的獨特寡核苷酸序列。

14、可替代地，所述核酸骨架可以包含dna磚塊，或由dna磚塊組成。這些dna磚塊是較短長度的寡核苷酸，其具有重疊的雜交區(qū)段，以便相互結合并組裝所述骨架。在這種情況下，所述標記物的寡核苷酸可以形成所述核酸骨架的一個組成部分。結合至所述dna磚塊的所述較短長度的寡核苷酸上的附著位點，以生成所述核酸骨架。

15、優(yōu)選地，在測序之前，在具體的可替代方案中在連接之前或在擴增之前，從所述標志物的所述核酸骨架中釋放所述標記物。這能夠特別穩(wěn)健地測序。

16、優(yōu)選地，在測序之前，對所述靶基因序列和所述標記物的寡核苷酸部分進行擴增，具體地，通過添加引物和進行pcr。具體地，在釋放所述靶基因序列之后進行這個步驟。所述擴增可以進一步包括，在擴增產物中引入限制性位點或連接位點。這能夠特別穩(wěn)健地測序。

17、特別優(yōu)選地，所述標志物的所述標記物包含切割位點，所述切割位點被配置為將所述染料從所述標記物的寡核苷酸中分離，并且其中在連接之前，或者可替代地在擴增之前，在所述切割位點將每個標記物的所述染料從所述標記物的所述寡核苷酸上切除。這能夠特別穩(wěn)健地測序。

18、優(yōu)選地，所述液滴是液體滴，具體地，具有離散體積的液體滴，第一液體(或第一流體)在不可混溶的第二液體(或第二流體)中的液體滴(liquid?droplets)，或者固體滴(solid?droplets))。這能夠在同一體積中處理所述多個細胞，同時在所述液滴內使所述標志物保持與相應的細胞締合。

19、所述液體滴可以基于水-油乳液的液滴技術。這方面的示例包括微流控生成的液滴，諸如bio-rad微滴式數字pcr技術。

20、固體滴可以包含聚合化合物，尤其包含水凝膠。這能夠特別容易地處理所述液滴中的細胞與所述標志物。關于包含細胞的水凝膠液滴或珠的其他示例，其包括用于對包含細胞的液滴進行成像的通用方法，參考專利申請pct/ep2021/058785和pct/ep2021/061754，其內容通過引用完全并入本文。

21、此外，文件wo?2019/028166?a1公開了適合用于對珠內的基因序列進行測序的水凝膠珠。

22、優(yōu)選地，所述提供液滴的步驟包括將細胞和標志物嵌入在液滴中，優(yōu)選地通過微流控裝置。這能夠特別有效地將細胞和標志物嵌入在所述液滴中。

23、優(yōu)選地，在所述液滴中培養(yǎng)所述細胞，尤其在從所述細胞中釋放所述靶基因序列之前。這能夠在一個時間段期間或之后對細胞進行分析。

24、優(yōu)選地，獲取具有所述至少一個細胞和所述至少一種標志物的所述液滴中的至少一個液滴的光學讀出。具體地，這在釋放所述靶基因序列之前獲取。這能夠在視覺上分析所述液滴內的所述細胞以及鑒定所述標志物。

25、所述光學讀出可以是基于圖像的讀出，其可以在顯微鏡(例如點掃描共聚焦(point-scanning?confocal)或基于相機/寬場成像系統(tǒng)(例如轉盤式顯微鏡、光片熒光顯微鏡、光場顯微鏡、體視顯微鏡))上獲取。此外，所述光學讀出可以是非基于圖像的讀出，例如在具有至少一個點檢測器或線檢測器的細胞計數器或基于流通的讀出裝置中。讀出可以由離散的讀出組成，例如發(fā)射光譜或圖像堆棧的單次采集；讀出可以是讀出數據流，例如在點掃描共聚焦或細胞計數器中其基本上是連續(xù)的。此外，讀出可以是一系列圖像，例如光譜或高光譜圖像堆棧，其中每幅圖像都記錄了不同波長帶的熒光發(fā)射。

26、所述光學讀出可以由用于執(zhí)行熒光多色讀取或成像的讀出裝置生成。所述讀出裝置通常包括至少一個激發(fā)光源、包括至少一個檢測通道的檢測系統(tǒng)，并可以進一步包括濾光器和/或色散型光學元件，諸如棱鏡和/或光柵，以將激發(fā)光傳輸到樣品和/或將來自樣品的發(fā)射光傳輸到檢測器或檢測器的適當區(qū)域。所述檢測系統(tǒng)可以包括多個檢測通道，其可以是并行檢測多個光譜帶的光譜檢測器，或是檢測光譜的連續(xù)部分的高光譜檢測器。所述檢測系統(tǒng)包括至少一個檢測器，其可以是點檢測器(例如光電倍增管、雪崩二極管、混合式檢測器)、陣列檢測器、相機、高光譜相機。所述檢測系統(tǒng)可以像通常在細胞計數器的情況中那樣記錄每個通道的強度，或者可以像在讀板器或顯微鏡的情況中那樣記錄圖像的成像檢測系統(tǒng)。具有一個檢測通道的讀出裝置，例如相機或光電倍增管，可以使用例如不同的激發(fā)帶和發(fā)射帶，生成具有多個檢測通道的讀出。

27、特別優(yōu)選地，在所述液滴中的所述至少一個液滴的所述光學讀出中，基于所述標志物的每個標記物的所述至少一種染料，確定所述液滴中的所述至少一種標志物是。這能夠基于所述標志物的所述染料來鑒定所述標志物。

28、優(yōu)選地，在對所述液滴中的所述至少一個液滴中的所述測序構建體進行測序期間生成的測序數據中，確定所述附著寡核苷酸部分和所述編碼寡核苷酸部分的序列，并且其中，基于在所述測序數據中存在所述序列和在所述至少一個液滴中存在的所述標志物的情況下，將所述至少一個液滴的所述測序數據與所述至少一個液滴的所述光學讀出是相關聯的。這能夠有效地將所述光學讀出與所述測序數據相聯系。因此，例如，所述光學讀出中鑒定的表型可以與所述測序數據中鑒定的特定基因型相聯系。

29、優(yōu)選地，通過所述至少一個細胞的mrna的逆轉錄，生成所述靶基因序列。這能夠對特別多樣化的靶基因序列的測序。

30、優(yōu)選地，所述多個細胞是免疫細胞，并且其中所述靶基因序列是免疫球蛋白基因序列，尤其vdj序列。這能夠例如有效鑒定大量的免疫細胞的免疫球蛋白基因序列。

31、優(yōu)選地，每個液滴都還包含至少一個非免疫細胞，并且其中所述至少一個免疫細胞對所述非免疫細胞的抗原具有特異性。這能夠有效鑒定對所述非免疫細胞的抗原具有特異性的免疫球蛋白基因序列。

32、優(yōu)選地，所述連接步驟包括將所述液滴中的一個液滴中的所述細胞的所有靶基因序列一起連接至所述液滴中的一個液滴中的所述標志物的所述標記物，以生成所述測序構建體。具體地，將所有靶基因序列連接至所述標志物的所述標記物的寡核苷酸，尤其連接至所述標志物的所述標記物的所述編碼寡核苷酸部分和所述附著寡核苷酸部分。這能夠穩(wěn)健地生成所述測序構建體。此外，這能夠特別有效地對所述測序構建體進行測序，而無需在測序之前分離各個液滴。具體地，這能夠實現所述至少一個液滴的測序數據與所述至少一個液滴的所述光學讀出之間的特別穩(wěn)健的相關性。

33、優(yōu)選地，將所有液滴中的所述測序構建體匯集并一起測序。這能夠特別有效地對所述測序構建體進行測序，而無需在測序之前分離各個液滴。