專利名稱：簡(jiǎn)易的低聚木糖平均聚合度的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定方法，具體涉及一種簡(jiǎn)易的低聚木糖平均聚合度的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
低聚木糖亦稱木寡糖(xylooligosaccharides),由2 7個(gè)D-木糖以￠-1 , 4-木糖苷鍵結(jié)合而成，是功能性低聚糖家族中的一個(gè)重要成員。它的甜度比蔗糖和葡萄糖均低，與麥芽糖差不多，約為蔗糖的40%。低聚木糖對(duì)pH值及熱的穩(wěn)定性較好，即使是在酸性條件(pH=2. 5 7)加熱也基本不分解，適合用于酸奶、乳酸菌飲料和碳酸飲料等酸性飲料中。低聚木糖極難被消化吸收，腸道內(nèi)殘存率高，具有極好的雙歧桿菌增殖性，其選擇利用性高于其它功能性低聚糖。由于低聚木糖是幾種寡聚木聚糖的總稱，其水溶液為混合物，因此在檢測(cè)過(guò)程中對(duì)木聚糖的測(cè)定是通過(guò)測(cè)定各組分的濃度的方法來(lái)檢測(cè)低聚木糖的，現(xiàn)在普遍采用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)的方法(詳見(jiàn)國(guó)標(biāo)QB/T2984-2008)，預(yù)先測(cè)定各組分的標(biāo)樣然后依次測(cè)定各組分濃度。此方法能詳細(xì)的以具體數(shù)字的方式顯示出低聚木糖各個(gè)組分的含量，但是由于市面上低聚木糖的標(biāo)樣不全，只能買到部分組分的標(biāo)樣，因此在定量計(jì)算時(shí)多采用其中一種組分的方程計(jì)算其他組分，造成了定量的不準(zhǔn)確。此外使用HPLC方法檢測(cè)，由于儀器昂貴、檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)，并且無(wú)法從宏觀上對(duì)低聚木糖品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，造成表觀上不直接， 無(wú)法直觀的對(duì)低聚木糖含量有直接的認(rèn)識(shí)。國(guó)標(biāo)GB/T23747-2009通過(guò)液相測(cè)定低聚木糖水解前后的木糖含量，計(jì)算出由低聚木糖水解所得的木糖含量并除以平均轉(zhuǎn)化系數(shù)進(jìn)而得到低聚木糖的濃度，通過(guò)此方法測(cè)定的低聚木糖濃度能直觀的反應(yīng)溶液中平均低聚木糖濃度。由于低聚木糖的聚合度越小，特別是木二的濃度越高該低聚木糖的品質(zhì)越好，但由此國(guó)標(biāo)測(cè)得的濃度對(duì)應(yīng)的平均聚合度無(wú)法判斷，因而無(wú)法宏觀的判斷低聚木糖的品質(zhì)給宏觀判定低聚木糖品質(zhì)帶來(lái)了不便。此外該方法同樣需要HPLC，使得沒(méi)有該設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室、工廠判定困難。由于每一個(gè)低聚木糖分子含有一個(gè)還原端糖，假設(shè)每一個(gè)低聚木糖總共含有n個(gè)木糖單元，此時(shí)n為該低聚木糖的聚合度。n等同于通過(guò)完全水解低聚木糖所得到的還原性木糖的個(gè)數(shù)。由于樣品中含有聚合度和濃度不等的低聚木糖和木糖分子，因此為了方便說(shuō)明低聚木糖中的聚合度和濃度等情況，采用平均聚合度N作為表征樣品中聚合度的平均值。其定義為
N =樣品中總糖濃度(所有低聚糖水解成單糖+起始單糖濃度)
還原糖濃度
通過(guò)低聚木糖溶液中總糖濃度和還原糖濃度可以測(cè)定低聚木糖在水溶液中的整體聚合度N，從而能對(duì)低聚木糖品質(zhì)有個(gè)宏觀的判定。當(dāng)N=I則溶液中全為木糖，當(dāng)N數(shù)值偏小則可以判定溶液中低聚木糖組分中聚合較小的組分含量較高。在分離純化過(guò)程中N的變換能反映出各個(gè)組分在溶液中的變化情況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)易的低聚木糖平均聚合度的測(cè)定方法，該測(cè)定方法對(duì)儀器要求不高，簡(jiǎn)單易于操作，通過(guò)測(cè)定平均聚合度這一宏觀指標(biāo)來(lái)直觀的反應(yīng)低聚木糖品質(zhì)。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是該測(cè)定方法包括以下步驟
(1)標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定低聚木糖液的總糖濃度采用苯酚-濃硫酸法，苯酚-濃硫酸法測(cè)定步驟及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備如下(1)標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液的配制先制備lmol/L的標(biāo)準(zhǔn)木糖液，再分別稀釋到200、180、150、100、60、50、30、20、10 uM/L的木糖液；(2) 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線9支試管分別移取Iml的200、180、150、100、60、50、30、20、10 uM/L的木糖液，加入25ul的質(zhì)量濃度80%的苯酹，迅速加入2. 5ml的濃硫酸搖勻，靜置lOmin，再置于25_30°C的恒溫水池 10-20min，取出冷卻，在480nm測(cè)其吸光值；
(2)標(biāo)準(zhǔn)樣品還原糖濃度的測(cè)定采用DNS法或BCA法，其中DNS法適用于糖濃度相對(duì)較高的溶液，測(cè)量范圍在200-5000mg/L ;而B(niǎo)CA法適合測(cè)量糖濃度低的糖溶液，測(cè)量范圍在 0. 4-9mg/L ；DNS法測(cè)定步驟及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備如下(1)配制DNS試劑將10. 6g的3，5- 二硝基水楊酸和19. Sg氫氧化鈉溶于1416ml的蒸餾水中，完全溶解后加入360g的酒石酸鉀鈉、7. 6ml的苯酚和8. 3g的亞硫酸鈉，50°C溶解混勻，同時(shí)確保該溶液為堿性；(2)配制標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液先配置lmol/L的木糖溶液，再稀釋到25、20、18、15、12、10、5、2mM/L的木糖液；⑶制備標(biāo)準(zhǔn)曲線取8支試管分別移取Iml的25、20、18、15、12、10、5、2 mM/L的木糖溶液和Iml的蒸餾水，加入3mLDNS試劑于沸水浴顯色5min，冰水浴冷卻，取出至常溫，吸取 200ul的糖液放入2. 5ml的蒸餾水于比色皿中，測(cè)定540nm的吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；BCA 法測(cè)定步驟及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備如下⑴配制A液分別稱取0.971g 2’ 2-聯(lián)喹啉-4’ 4-二羧酸鈉、27. 14g碳酸鈉和12. Ig碳酸氫鈉溶于500ml蒸餾水中，加熱溶解；(2)配制B液分別稱取0. 624g的硫酸銅、0. 631g的L-serine于500ml蒸懼水中；(3)配制標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液 先配制lmol/L的木糖溶液，再最終稀釋到60、50、40、30、15、10、5 uM各5ml ；(4)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線7支試管內(nèi)分別取Iml A液和Iml B液混合均勻，再加入2ml標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液搖勻，在 75°C保存20-30min，室溫冷卻之后在560nm下測(cè)吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(3)樣品的測(cè)定把樣品溶液稀釋到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之中，采用同標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定相同的步驟進(jìn)行樣品的測(cè)定，得到總糖濃度和還原端糖濃度；
(4)平均聚合度的計(jì)算將步驟(3)得到的總糖濃度和還原端糖濃度采用公式計(jì)算得平均聚合度，公式為平均聚合度=總糖濃度/還原端糖濃度；
(5 )利用平均聚合度對(duì)低聚木糖水溶液判定低聚木糖是指2 7個(gè)D-木糖以￠-1 ,4-木糖苷鍵結(jié)合而成的寡聚木聚糖，Imol低聚木糖分解成木糖的范圍為2 7mol，平均聚合度的數(shù)值范圍應(yīng)該為廣7 ;當(dāng)平均聚合度數(shù)值為I時(shí)，則說(shuō)明溶液中的糖溶液為木糖溶液；I < N < 2時(shí)，說(shuō)明低聚木糖中有木糖混在其中；2 < N < 7時(shí)，數(shù)值越大則說(shuō)明低聚木糖的聚合度越高；數(shù)值超過(guò)7時(shí)，則說(shuō)明溶液中非低聚木糖含量較大。本發(fā)明提供了一個(gè)簡(jiǎn)易的評(píng)估低聚木糖溶液組分聚合度的方法，此方法能簡(jiǎn)單快捷的評(píng)測(cè)出低聚木糖各組分在溶液中的變化，特別適用于低聚木糖工業(yè)化生產(chǎn)、分離純化過(guò)程中宏觀的判定。


圖I為總糖測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2 DNS測(cè)定還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3 BCA測(cè)定還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)解決方案，這些實(shí)施例不能理解為是對(duì)技術(shù)解決方案的限制。實(shí)例中所使用的高效液相色譜條件為shodex sugar sp0810色譜柱,流動(dòng)相水， 流速0. 5ml/min,柱溫85°C，檢測(cè)器采用shodexRl-201H示差折光檢測(cè)器。實(shí)施例I :取低聚木糖液離心稀釋至50-200 uM/L ;移取Iml的低聚木糖液稀釋液，加入25ul的質(zhì)量濃度80%的苯酚，迅速加入2. 5ml的濃硫酸搖勻，靜置lOmin，再置于 25-300C的恒溫水池10-20min，取出冷卻，在480nm測(cè)其總糖吸光值。取低聚木糖液離心稀釋至5-25 mM/L，試管中移取Iml稀釋后的低聚木糖溶液和Iml的蒸餾水，加入3mLDNS試劑于沸水浴顯色5min，冰水浴冷卻，取出至常溫，吸取200ul的糖液放入2. 5ml的蒸餾水于比色皿中，測(cè)定540nm的還原糖吸光值；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的總糖和還原糖分別為
7.04g/L、還原糖4. 68g/L，平均聚合度N為I. 5 ;HPLC檢測(cè)結(jié)果表明該低聚木糖液組分以木
二、木三、木四為主，混有大量的木糖。實(shí)施例2 :稱取99%的木糖標(biāo)樣配置lmol/L，再稀釋到50-200 uM/L ;試管中移取 Iml木糖稀釋液，加入25ul的質(zhì)量濃度80%的苯酚，迅速加入2. 5ml的濃硫酸搖勻，靜置 lOmin，再置于25-30°C的恒溫水池10_20min，取出冷卻，在480nm測(cè)其總糖吸光值。取木糖液離心稀釋至5-25mM/L，試管中移取Iml的木糖稀釋溶液和Iml的蒸餾水，加入3mLDNS 試劑于沸水浴顯色5min，冰水浴冷卻，取出至常溫，吸取200ul的糖液放入2. 5ml的蒸餾水于比色皿中，測(cè)定540nm的還原糖吸光值；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的總糖和還原糖分別為
11.43g/L、還原糖11. 26g/L，平均聚合度N為I ;HPLC圖譜顯示只有單一的木糖峰。實(shí)施例3 :取寡聚木聚糖配置濃度為50-200 uM/L溶液；試管中移取Iml的稀釋液，加入25ul的質(zhì)量濃度80%的苯酚，迅速加入2. 5ml的濃硫酸搖勻，靜置lOmin，再置于 25-30°C的恒溫水池10-20min，取出冷卻，在480nm測(cè)其總糖吸光值；取寡聚木聚糖配置濃度為5-25mM/L ;試管中移取Iml的稀釋溶液和Iml的蒸餾水，加入3mLDNS試劑于沸水浴顯色5min，冰水浴冷卻，取出至常溫，吸取200ul的糖液放入2. 5ml的蒸餾水于比色皿中，測(cè)定540nm的還原糖吸光值；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的總糖和還原糖分別為8. 03g/L、還原糖0. 74g/L，平均聚合度N為10. 8 ；HPLC檢測(cè)結(jié)果表明該溶液在低聚木糖保留時(shí)間內(nèi)幾乎沒(méi)有檢測(cè)到出峰。實(shí)施例4 :取低聚木糖液離心稀釋至50-200 uM/L ;移取Iml的低聚木糖液稀釋液，加入25ul的質(zhì)量濃度80%的苯酚，迅速加入2. 5ml的濃硫酸搖勻，靜置lOmin，再置于25-30°C的恒溫水池10-20min，取出冷卻，在480nm測(cè)其總糖吸光值。取低聚木糖液離心稀釋至20-60 mM/L，試管內(nèi)分別取Iml A液和Iml B液混合均勻，再加入2ml低聚木糖稀釋溶液搖勻，在75°C保存30min，室溫冷卻之后在560nm下測(cè)其還原糖吸光值；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的總糖和還原糖分別為總糖16. 13g/L、還原糖4.68g/L，平均聚合度N為
3.44 ；HPLC檢測(cè)結(jié)果表明該低聚木糖液組分以木三含量占整個(gè)溶液組分含量61. 3%、木二為11. 2%、木四為9. 3%，并混有少量的木五及木六。實(shí)施例5 :取低聚木糖液離心稀釋至50-200 uM/L ;移取Iml的低聚木糖液稀釋液，加入25ul的質(zhì)量濃度80%的苯酚，迅速加入2. 5ml的濃硫酸搖勻，靜置lOmin，再置于 25-300C的恒溫水池10-20min，取出冷卻，在480nm測(cè)其總糖吸光值。取低聚木糖液離心稀釋至5-25 mM/L,試管中移取Iml稀釋后的低聚木糖溶液和Iml的蒸餾水，加入3mLDNS試劑于沸水浴顯色5min，冰水浴冷卻，取出至常溫，吸取200ul的糖液放入2. 5ml的蒸餾水于比色皿中，測(cè)定540nm的還原糖吸光值；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的總糖和還原糖分16. 34g/L、 還原糖3. 62g/L，平均聚合度N為4. 5 ;HPLC檢測(cè)結(jié)果表明該低聚木糖液組分中木三含量占 30%、木四占36. 1%為主，木五12. 2%，木六8%，并混有少量的木二及木糖。
權(quán)利要求
1.簡(jiǎn)易的低聚木糖平均聚合度的測(cè)定方法，其特征在于該測(cè)定方法包括以下步驟(1)標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定低聚木糖液的總糖濃度采用苯酚-濃硫酸法，苯酚-濃硫酸法測(cè)定步驟及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備如下(1)標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液的配制先制備lmol/L的標(biāo)準(zhǔn)木糖液，再分別稀釋到200、180、150、100、60、50、30、20、10 uM/L的木糖液；(2) 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線9支試管分別移取Iml的200、180、150、100、60、50、30、20、10 uM/L的木糖液，加入25ul的質(zhì)量濃度80%的苯酹，迅速加入2. 5ml的濃硫酸搖勻，靜置lOmin，再置于25_30°C的恒溫水池 10-20min，取出冷卻，在480nm測(cè)其吸光值；(2)標(biāo)準(zhǔn)樣品還原糖濃度的測(cè)定采用DNS法或BCA法，其中DNS法適用于糖濃度相對(duì)較高的溶液，測(cè)量范圍在200-5000mg/L ;而B(niǎo)CA法適合測(cè)量糖濃度低的糖溶液，測(cè)量范圍在 0. 4-9mg/L ；DNS法測(cè)定步驟及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備如下(1)配制DNS試劑將10. 6g的3，5- 二硝基水楊酸和19. Sg氫氧化鈉溶于1416ml的蒸餾水中，完全溶解后加入360g的酒石酸鉀鈉、7. 6ml的苯酚和8. 3g的亞硫酸鈉，50°C溶解混勻，同時(shí)確保該溶液為堿性；(2)配制標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液先配置lmol/L的木糖溶液，再稀釋到25、20、18、15、12、10、5、2mM/L的木糖液；⑶制備標(biāo)準(zhǔn)曲線取8支試管分別移取Iml的25、20、18、15、12、10、5、2 mM/L的木糖溶液和Iml的蒸餾水，加入3mLDNS試劑于沸水浴顯色5min，冰水浴冷卻，取出至常溫，吸取 200ul的糖液放入2. 5ml的蒸餾水于比色皿中，測(cè)定540nm的吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；BCA 法測(cè)定步驟及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備如下(1)配制A液分別稱取0. 971g 2’ 2-聯(lián)喹啉-4’ 4- 二羧酸鈉、27. 14g碳酸鈉和12. Ig碳酸氫鈉溶于500ml蒸餾水中，加熱溶解；(2)配制B液分別稱取0. 624g的硫酸銅、0. 631g的L-serine于500ml蒸懼水中；(3)配制標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液 先配制lmol/L的木糖溶液，再最終稀釋到60、50、40、30、15、10、5 uM各5ml ；(4)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線7支試管內(nèi)分別取Iml A液和Iml B液混合均勻，再加入2ml標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液搖勻，在 75°C保存30min，室溫冷卻之后在560nm下測(cè)吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)樣品的測(cè)定把樣品溶液稀釋到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之中，采用同標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定相同的步驟進(jìn)行樣品的測(cè)定，得到總糖濃度和還原端糖濃度；(4)平均聚合度的計(jì)算將步驟(3)得到的總糖濃度和還原端糖濃度采用公式計(jì)算得平均聚合度，公式為平均聚合度=總糖濃度/還原端糖濃度；(5 )利用平均聚合度對(duì)低聚木糖水溶液判定低聚木糖是指2 7個(gè)D-木糖以￠-1 ,4-木糖苷鍵結(jié)合而成的寡聚木聚糖，Imol低聚木糖分解成木糖的范圍為2 7mol，平均聚合度的數(shù)值范圍應(yīng)該為廣7 ;當(dāng)平均聚合度數(shù)值為I時(shí)，則說(shuō)明溶液中的糖溶液為木糖溶液；I < N < 2時(shí)，說(shuō)明低聚木糖中有木糖混在其中；2 < N < 7時(shí)，數(shù)值越大則說(shuō)明低聚木糖的聚合度越高；數(shù)值超過(guò)7時(shí)，則說(shuō)明溶液中非低聚木糖含量較大。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種簡(jiǎn)易的低聚木糖平均聚合度的測(cè)定方法，通過(guò)低聚木糖溶液中總糖濃度和還原糖濃度測(cè)定低聚木糖在水溶液中的整體聚合度N，從而能對(duì)低聚木糖品質(zhì)有個(gè)宏觀的判定；當(dāng)N=1則溶液中全為木糖，當(dāng)N數(shù)值偏小則可以判定溶液中低聚木糖組分中聚合較小的組分含量較高；該測(cè)定方法對(duì)儀器要求不高，簡(jiǎn)單易于操作，在分離純化過(guò)程中N的變換能反映出各個(gè)組分在溶液中的變化情況，通過(guò)測(cè)定平均聚合度這一宏觀指標(biāo)來(lái)直觀的反應(yīng)低聚木糖品質(zhì)。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102608046SQ20121005463
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月5日
發(fā)明者周玉珍, 熊濤, 熊鵬 申請(qǐng)人:熊鵬