本發(fā)明涉及蛋白功能預測領域以及基因工程領域，具體涉及一種與peir裂解酶序列同源的產(chǎn)甲烷菌裂解酶及其應用。
背景技術(shù)：
1、甲烷對全球氣候變化影響顯著，其在20年尺度下的全球變暖潛能值是co2的82.5倍，反芻動物在消化過程中會產(chǎn)生大量的甲烷，是甲烷排放的重要來源，瘤胃微生物能夠分解纖維素和半纖維素等植物細胞壁成分，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸、co2和氫氣等中間產(chǎn)物，進而被產(chǎn)甲烷菌利用生成甲烷。
2、產(chǎn)甲烷菌屬于古菌，是不同于細菌、系統(tǒng)進化獨特的一類微生物，其細胞壁組成與細菌存在很大差異。假肽聚糖是古菌中存在的不同的細胞壁聚合物之一，僅在甲烷桿菌目和甲烷火菌目中發(fā)現(xiàn)。假肽聚糖與細菌細胞壁肽聚糖具有相似的整體三維結(jié)構(gòu)。甲烷菌假肽聚糖細胞壁的特殊性主要體現(xiàn)在以下幾個方面，其一，假肽聚糖細胞壁存在古菌特異性糖，其聚糖骨架為n-乙酰氨基塔羅糖醛酸。其二，使用β-1,3-糖苷鍵將n-乙酰氨基葡萄糖或n-乙酰半乳糖胺與聚糖骨架連接。最后，在肽鏈中缺乏d型氨基酸，在肽和肽間交聯(lián)中使用ε-和γ-異肽鍵。這些差異導致含有假肽聚糖層的產(chǎn)甲烷菌對溶菌酶和其他細菌細胞壁水解酶具有抗性。因此，有必要深入研發(fā)能夠針對產(chǎn)甲烷菌假肽聚糖進行水解的酶類。
3、已有研究從瘤胃產(chǎn)甲烷菌methanobrevibacter?ruminantium?m1的基因組中，發(fā)現(xiàn)了一種甲烷菌裂解酶peir(參考文獻：tailored?nanoparticles?with?the?potentialto?reduce?ruminant?methane?emissions)。但是peir的結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定，不利于后續(xù)應用。因此，本發(fā)明利用序列同源搜索評估蛋白與peir的同源性，最終發(fā)現(xiàn)了一系列甲烷菌裂解酶，并通過異源表達來表征其特征并進行體外效果評估，對于降低畜牧業(yè)甲烷產(chǎn)量，提高飼料轉(zhuǎn)化效率等實際生產(chǎn)方面具有重要意義和應用價值。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明目的在于針對當前畜牧業(yè)尤其是反芻動物生產(chǎn)中甲烷產(chǎn)量高且缺乏綠色有效的甲烷抑制劑的現(xiàn)狀，運用日益增長的微生物組測序數(shù)據(jù)資源和計算生物學領域的熱點技術(shù)，通過系列數(shù)據(jù)挖掘獲得與peir同源的一系列甲烷菌裂解酶pei008、pei099、pei137、pei185、pei231、pei274、pei284。經(jīng)過原核系統(tǒng)表達后，重組蛋白粗酶液具有良好的抑制甲烷生成的作用。
2、本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種與peir裂解酶序列同源的產(chǎn)甲烷菌裂解酶，該裂解酶的氨基酸序列為如seq?id?no.1～seq?id?no.7所示中的一種。
3、進一步地，裂解酶篩選過程如下：
4、(1)瘤胃宏基因組數(shù)據(jù)收集與古菌病毒蛋白挖掘：
5、收集已發(fā)表的瘤胃宏基因組組裝數(shù)據(jù)、宏基因組組裝基因組和病毒基因組數(shù)據(jù)，使用genomad挖掘、篩選病毒基因組，使用checkv去除多宿主污染、基因組不完整的病毒基因組并剪除宿主序列污染，并以95％的平均核苷酸相似性、85％的比對覆蓋率為閾值進行種水平去冗余得votus，使用iphop預測votus潛在宿主并保留侵染甲烷桿菌目產(chǎn)甲烷古菌的病毒基因組，利用prodigal-gv預測所編碼的蛋白；利用merops肽酶數(shù)據(jù)庫注釋所得的蛋白是否屬于肽酶并去除非肽酶的部分得到候選蛋白。
6、(2)基于序列同源性挖掘和peir同源的蛋白：
7、利用序列比對軟件blastp和基于隱馬爾可夫模型的序列層面同源軟件hh-suite3對步驟(1)篩選得到的候選蛋白進行比對分析，以判斷其是否在序列層面上與已知的peir裂解酶具有同源性；通過上述序列同源性分析，篩選出在序列維度與peir同源的甲烷菌裂解酶。
8、進一步地，確定蛋白是否屬于肽酶的具體過程為：基于目標底物是糖骨架間的肽鏈，將所得的病毒蛋白經(jīng)diamond?blastp比對merops肽酶數(shù)據(jù)庫注釋，保留是肽酶的蛋白序列做后續(xù)分析。
9、進一步地，滿足以下閾值條件的蛋白被認為在序列層面與peir具有同源性：blastp比對結(jié)果的e-value≤1e-5且hh-suite3比對結(jié)果的e-value≤1e-5。
10、進一步地，基于包含產(chǎn)甲烷菌裂解酶基因的重組載體和重組菌，進行發(fā)酵誘導表達，并通過后續(xù)提純獲得目標蛋白，并基于目標蛋白對體外微生物甲烷產(chǎn)生的效果進行評估。
11、另一方面，本發(fā)明還提供了一種與peir結(jié)構(gòu)同源的產(chǎn)甲烷菌裂解酶在抑制甲烷生成中的應用。
12、本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明測定產(chǎn)生和廣泛收集了大量瘤胃微生物組測序數(shù)據(jù)，利用系列生物信息軟件，從中鑒定產(chǎn)甲烷菌病毒編碼的蛋白序列，并進一步分析這些蛋白與peir蛋白間的序列同源性。最終，本發(fā)明成功獲得了系列產(chǎn)甲烷菌裂解酶。為了實現(xiàn)這些裂解酶的表達，本發(fā)明設計了多段引物以合成目標序列，并在原核表達系統(tǒng)中成功表達。通過對粗酶液的檢測，本發(fā)明在體外產(chǎn)氣試驗中驗證了這些裂解酶在降低甲烷產(chǎn)量方面的有效性。該系列產(chǎn)甲烷菌裂解酶展現(xiàn)了良好的研究價值和生產(chǎn)應用潛力，為未來在甲烷減排領域的應用奠定了基礎。
1.一種與peir裂解酶序列同源的產(chǎn)甲烷菌裂解酶，其特征在于，該裂解酶的氨基酸序列為如seq?id?no.1～seq?id?no.7所示中的一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種與peir裂解酶序列同源的產(chǎn)甲烷菌裂解酶，其特征在于，該裂解酶篩選過程如下：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種與peir裂解酶序列同源的產(chǎn)甲烷菌裂解酶，其特征在于，確定蛋白是否屬于肽酶的具體過程為：基于目標底物是糖骨架間的肽鏈，將所得的病毒蛋白經(jīng)diamond?blastp比對merops肽酶數(shù)據(jù)庫注釋，保留是肽酶的蛋白序列做后續(xù)分析。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種與peir裂解酶序列同源的產(chǎn)甲烷菌裂解酶，其特征在于，滿足以下閾值條件的蛋白被認為在序列層面與peir具有同源性：blastp比對結(jié)果的e-value≤1e-5且hh-suite3比對結(jié)果的e-value≤1e-5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種與peir裂解酶序列同源的產(chǎn)甲烷菌裂解酶，其特征在于，基于包含產(chǎn)甲烷菌裂解酶基因的重組載體和重組菌，進行發(fā)酵誘導表達，并通過后續(xù)提純獲得目標蛋白，并基于目標蛋白對體外微生物甲烷產(chǎn)生的效果進行評估。
6.一種與peir裂解酶序列同源的產(chǎn)甲烷菌裂解酶在抑制甲烷生成中的應用。