本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及一種肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原，編碼該肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原的基因序列，質(zhì)粒，含有該質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，由該肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原制備的肺炎衣原體抗體檢測(cè)試劑盒，以及該肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原在檢測(cè)人肺炎衣原體感染中的用途。

背景技術(shù)：

1、衣原體(chlamydia)是一種革蘭氏陰性病原體，能通過(guò)細(xì)菌濾器、在細(xì)胞內(nèi)寄生、有獨(dú)特發(fā)育周期。多呈球狀、有細(xì)胞壁，有細(xì)胞膜，它是一類(lèi)在真核細(xì)胞內(nèi)營(yíng)專(zhuān)性能量寄生的g-原核微生物，直徑大約0.3-0.5微米，它無(wú)運(yùn)動(dòng)能力，廣泛寄生于人類(lèi)、哺乳動(dòng)物及鳥(niǎo)類(lèi)。衣原體屬包括11種：沙眼衣原體(chlamydia?trachomatis，以下簡(jiǎn)稱(chēng)為ctr，人類(lèi)性傳播疾病和眼部感染)、鼠衣原體(在小鼠和倉(cāng)鼠中引起疾病)、豬衣原體(感染豬)、肺炎衣原體chlamydiapneumoniae(導(dǎo)致人類(lèi)呼吸道感染)、pecorum衣原體(牲畜中的常見(jiàn)病原體)、鸚鵡螺衣原體(在鳥(niǎo)類(lèi)中流行并導(dǎo)致人類(lèi)肺炎)、流產(chǎn)衣原體(導(dǎo)致哺乳動(dòng)物流產(chǎn))、貓衣原體(在貓中發(fā)現(xiàn)的物種)、caviae衣原體(在豚鼠中引起感染的物種)、c.禽球菌(包括來(lái)自鴿子和鸚鵡的菌株)和雞球菌(來(lái)自家禽的菌株)。能傳染人類(lèi)的有肺炎衣原體chlamydiapneumoniae，沙眼衣原體，鸚鵡螺衣原體，流產(chǎn)衣原體。

2、肺炎衣原體(c.pneumoniae，以下簡(jiǎn)稱(chēng)為cpn)，也稱(chēng)肺炎嗜衣原體，可引起急性呼吸道疾病，包括肺炎、支氣管炎、鼻竇炎和咽炎等，目前只發(fā)現(xiàn)一種血清型。全世界超過(guò)50％的成年人曾經(jīng)感染過(guò)肺炎衣原體，會(huì)導(dǎo)致在10-15％的成人和兒童社區(qū)獲得性肺炎，感染者大多無(wú)明顯癥狀或癥狀輕微，重癥患者會(huì)有嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，感染多發(fā)生在深秋至寒冬以及春夏過(guò)渡時(shí)期。

3、肺衣igm抗體在發(fā)病后約2～3周出現(xiàn)，4～5周后達(dá)到峰值，在3～5個(gè)月后檢測(cè)不到。igg抗體在發(fā)病前30天緩慢產(chǎn)生，在發(fā)病后約3～4個(gè)月達(dá)到平穩(wěn)期。再次感染的病例中，igm抗體可能不存在，或者即使存在也可能是低滴度的，igg抗體出現(xiàn)的時(shí)間更早，在發(fā)病后1～2周內(nèi)出現(xiàn)。igm對(duì)肺炎原體有較早的血清學(xué)反應(yīng)，有助于急性肺炎原體感染的快速診斷。目前對(duì)于肺炎衣原體的檢測(cè)有以下方法：

4、病原體培養(yǎng)法：技術(shù)要求高、運(yùn)輸過(guò)程中容易失活，產(chǎn)量低，通常需要重復(fù)盲傳?？乖瓩z測(cè)法：樣本采集問(wèn)題，容易造成假陽(yáng)。pcr法：不易實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。提取程序、引物定義等缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，容易假陰。mif法：結(jié)果受到所使用的抗原準(zhǔn)備和負(fù)責(zé)閱讀和解釋它們的專(zhuān)業(yè)人員的經(jīng)驗(yàn)的影響?？贵w檢測(cè)法：交叉反應(yīng)性問(wèn)題、根據(jù)所使用抗原的敏感性和特異性的變化比較大。

5、由于便捷快速地檢測(cè)肺炎衣原體需要批量制備高質(zhì)量的cpn抗原，而目前現(xiàn)有技術(shù)制備的抗原有幾類(lèi)：

6、1.肺炎衣原體培養(yǎng)物及其裂解提取物：如lps抗原，缺乏lps的肺炎原體抗原，comc抗原，eb抗原。其缺點(diǎn)是成分復(fù)雜，批間差大，假陽(yáng)性高。

7、2.合成多肽抗原：如wo9857981，以色列，1997，提到的momp的4個(gè)可變區(qū)的肽(b)(c)(d)和(g)混合使用，檢測(cè)igg+iga抗體達(dá)到的靈敏度僅僅為77％而已，除此之外也有其它弊端：合成肽大多屬于線性表位，一般沒(méi)有形成高級(jí)結(jié)構(gòu)，無(wú)法產(chǎn)生構(gòu)象表位，活性不如全長(zhǎng)或者截短片段重組表達(dá)抗原；其檢測(cè)的抗體是igg，沒(méi)有測(cè)igm或者總抗體的應(yīng)用驗(yàn)證；其使用的方法學(xué)是elisa，只能在專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室借助酶標(biāo)儀操作，無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。

8、3.重組抗原：大多數(shù)采用的是momp，盡管它在cpn外膜組分占比60％，但是由于其與ctr的同源性達(dá)到80％，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性。在detection?ofchlamydia?pneumoniae-specific?antibodies?binding?to?the?vd2?and?vd3?regions?ofthe?major?outermembrane?protein，2003一文，提到肺炎衣原體momp的vd2和vd3區(qū)域僅被肺炎衣原體陽(yáng)性血清識(shí)別，提示存在物種特異性表位，但是這篇文章所用的標(biāo)本數(shù)量不足，無(wú)法充分證明完全無(wú)交叉；肺炎衣原體ompa基因vd2-vd3區(qū)重組蛋白在血清學(xué)診斷中的初步應(yīng)用，周洲，2007一文，提到其使用的vd2和vd3在148-291aa，但他們所用的抗原有至少3段連續(xù)ctr同源區(qū)，這會(huì)造成交叉反應(yīng)假陽(yáng)性。在chlamydia:what?is?on?the?outside?does?matter，2020，arlieke?gitsels一文，提到不同種衣原體間主要外膜蛋白的氨基酸同源性達(dá)到73％～80％。研究認(rèn)為，cpn的momp蛋白檢測(cè)抗體的能力差，且和ctr有嚴(yán)重交叉反應(yīng)，他們制作的蛋白大多是變性后的，失去了構(gòu)象表位。目前對(duì)于momp的研究最多，但是反饋的結(jié)果并不好，主要原因一是表達(dá)系統(tǒng)受限，原核表達(dá)無(wú)法制備出構(gòu)象表位的momp抗原，二是會(huì)與ctr有交叉反應(yīng)。

9、總之，目前cpn診斷抗原普遍存在的問(wèn)題是，制備方法落后，不利于批量生產(chǎn)；抗原區(qū)段選擇單一，尤其是與ctr等其它衣原體交叉反應(yīng)的同源區(qū)段沒(méi)有去除，采用落后的合成肽或者原核表達(dá)方式，無(wú)法展示抗原最佳構(gòu)象，活性不佳，導(dǎo)致靈敏度不高，特異性不好。因此，需要研發(fā)和制備表達(dá)量大，可溶性好，構(gòu)象天然具有優(yōu)異靈敏度和特異性的基因工程重組抗原，以用于elisa或?qū)游龇z測(cè)cpn抗體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的縮寫(xiě)：肺炎衣原體可以縮寫(xiě)為cpn，沙眼衣原體可以縮寫(xiě)為ctr。

2、本發(fā)明的第一目的是提供一種表達(dá)量大，可溶性好，構(gòu)象天然的肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原a或者b:a.具有seq?id?no：26所示的氨基酸序列；b.將a中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一到幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或者添加而衍生的蛋白質(zhì)并且不改變其親水性。其采用多個(gè)不與其它衣原體交叉反應(yīng)的免疫顯性表位區(qū)與融合蛋白嵌合表達(dá)，并通過(guò)連接肽相互間隔，當(dāng)其用于elisa或?qū)游龇庖邫z測(cè)cpn抗體時(shí)，可以改善現(xiàn)有試劑盒的靈敏度和特異性。

3、本發(fā)明的第二目的是提供編碼肺炎衣原體重組肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原的基因，其具有seq?id?no：27所示的核苷酸序列。

4、本發(fā)明的第三目的是提供含有編碼肺炎衣原體重組肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原的基因序列的質(zhì)粒。

5、本發(fā)明的第四目的是提供轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染編碼肺炎衣原體重組肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原基因序列表達(dá)質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。

6、本發(fā)明的第五目的是提供由肺炎衣原體重組肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原制備的肺炎衣原體抗體檢測(cè)試劑盒。

7、本發(fā)明的第六目的是提供肺炎衣原體重組肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原在檢測(cè)人肺炎衣原體感染中的用途。

8、由于目前肺炎衣原體抗原，普遍存在以下矛盾：一方面，由于肺炎衣原體基因有上千個(gè)，感染人之后，在不同人體內(nèi)，以及不同的感染時(shí)期，產(chǎn)生的抗體譜存在差異，導(dǎo)致無(wú)法用某一個(gè)蛋白檢測(cè)出絕大多數(shù)被感染人群的抗體；另一方面，由于cpn和ctr等其它種類(lèi)的衣原體基因同源性很高，某些具有免疫原性的蛋白極度同源，例如二者momp的同源性達(dá)到了80％以上。這就導(dǎo)致了制備cpn重組抗原面臨靈敏度和特異性的雙重考驗(yàn)。

9、由于單一蛋白質(zhì)靈敏度太低，而cpn物種內(nèi)部的基因同源性很高，cpn現(xiàn)在只發(fā)現(xiàn)一個(gè)血清型，因此具有一個(gè)可能性，即將不同cpn蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)表位區(qū)進(jìn)行嵌合表達(dá)，制備cpn重組多表位嵌合抗原。這類(lèi)cpn蛋白必須能夠特異性區(qū)分cpn和ctr感染者以免導(dǎo)致假陽(yáng)性，如文章antigenic?characterization?of?chlamydia?pneumoniae?isolated?inhiroshima,japan，1993；identification?of?two?novel?genes?encoding?97-to99kilodalton?outer?membrane?proteins?of?chlamydia?pneumoniae，1999；analysis?ofhumoral?immune?responses?to?recombinant?chlamydiapneumoniae?antigens，2020等所述。發(fā)明人在ncbi公布的cpn全基因組的各個(gè)orf中篩選具有潛在診斷價(jià)值的蛋白質(zhì)序列。綜合考慮之后，最終挑選了inca，momp，tarp，yopc，ywbm，pmp2，pmp6，pmp8，pmp11，pmp21，ct618和53kda這12個(gè)候選蛋白質(zhì)進(jìn)行克隆表達(dá)。成功表達(dá)了其中11個(gè)全長(zhǎng)蛋白。經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，這11個(gè)全長(zhǎng)蛋白各自單獨(dú)使用時(shí)雖然各自有一定靈敏度，但是有較高的假陽(yáng)性。分析原因可能是它們和ctr等其它病原體蛋白質(zhì)序列同源性區(qū)段導(dǎo)致的交叉反應(yīng)。

10、隨后重組表達(dá)這12個(gè)目的蛋白的截短的免疫優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段抗原，再次對(duì)比活性之后發(fā)現(xiàn)了6個(gè)具有靈敏度協(xié)同互補(bǔ)效應(yīng)的區(qū)段inca(323-378)，momp(209-267)，tarp(103-161)，ywbm(68-123)，pmp6(233-291)，53kda(290-340)，最后將它們6個(gè)嵌合表達(dá)成為一個(gè)單一的肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原cpnchimer6。

11、發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原cpnchimer6內(nèi)部的6個(gè)抗原片段在之前單獨(dú)使用時(shí)，都只能檢出不到一半的陽(yáng)性血清，但是嵌合表達(dá)之后能夠檢出絕大多數(shù)的陽(yáng)性血清。將該肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原cpnchimer6用于elisa平臺(tái)或者層析平臺(tái)檢測(cè)igg，檢測(cè)igm，雙抗原夾心法檢測(cè)總抗體，與對(duì)照產(chǎn)品相比都具有很好的靈敏度和特異性。

12、經(jīng)過(guò)檢索cpn基因組的orf并對(duì)比cpn和ctr蛋白質(zhì)序列差異，選擇inca，momp，tarp，yopc，ywbm，pmp2，pmp6，pmp8，pmp11，pmp21，ct618和53kda這12個(gè)候選蛋白質(zhì)進(jìn)行克隆表達(dá)，其氨基酸殘基如序列seq?id?no:1-12所示。

13、第一步是inca，momp，tarp，yopc，ywbm，pmp2，pmp6，pmp8，pmp11，pmp21，ct618和53kda這12個(gè)候選蛋白質(zhì)進(jìn)行密碼子優(yōu)化合成，兩端加入合適的酶切位點(diǎn)，合成的基因裝載入質(zhì)粒載體，進(jìn)行后續(xù)亞克隆操作。也可以采取其它方法，比如設(shè)計(jì)這12個(gè)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的基因引物，以cpn的基因組dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲取它們的orf基因。

14、將上述獲取的12個(gè)基因，通過(guò)酶切，瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因條帶，連接到合適的表達(dá)載體，陽(yáng)性克隆采取pcr，酶切或者測(cè)序等方案進(jìn)行鑒定。眾所周知的表達(dá)載體有很多種，在本發(fā)明實(shí)施例以pcdna3.4-topo為起始載體，但是其它未列出的載體也是可行的。

15、將上述亞克隆成功的12個(gè)質(zhì)粒，導(dǎo)入(轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染)到表達(dá)宿主細(xì)胞中。這里的宿主可以是原核或者真核，例如大腸桿菌，酵母，人類(lèi)，hek細(xì)胞等。為了提高表達(dá)量，還可以在基因合成之前預(yù)先對(duì)基因進(jìn)行密碼子物種優(yōu)化。

16、將分別(轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染)12個(gè)質(zhì)粒了表達(dá)宿主細(xì)胞，各自進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)，隨后在合適的時(shí)機(jī)進(jìn)行細(xì)胞收集。利用載體自帶的his標(biāo)簽進(jìn)行親和層析純化，或者使用其它方法比如離子交換等進(jìn)行純化。

17、將純化好的11個(gè)重組蛋白(其中pmp2由于表達(dá)量實(shí)在過(guò)低，這一步放棄了)，分別進(jìn)行包被96孔板，elisa間接法檢測(cè)對(duì)感染者和正常人血清的反應(yīng)性。

18、經(jīng)過(guò)對(duì)比總結(jié)發(fā)現(xiàn)，這11個(gè)全長(zhǎng)蛋白各自單獨(dú)使用時(shí)雖然各自有一定靈敏度，但是有較高的假陽(yáng)性。分析原因可能是它們和ctr等其它病原體蛋白質(zhì)序列同源性區(qū)段導(dǎo)致的交叉反應(yīng)。因此，發(fā)明人做出了以下改進(jìn)，選取每個(gè)蛋白里不與ctr等其它病原體同源性過(guò)高的免疫優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段。

19、用計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)序列可溶性，親水性，表面可及性選擇潛在優(yōu)勢(shì)表位區(qū)；分析cpn和ctr蛋白質(zhì)同源性，在選擇目標(biāo)區(qū)段時(shí)候必須避開(kāi)cpn和ctr同源性過(guò)高的區(qū)段。最終在inca，momp，tarp，yopc，ywbm，pmp2，pmp6，pmp8，pmp11，pmp21，ct618和53kda這12個(gè)蛋白各選取一個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段，inca(323-378)，momp(209-267)，tarp(103-161)，yopc(119-175)，ywbm(68-123)，pmp2(309-344)，pmp6(233-291)，pmp8(750-806)，pmp11(645-699)，pmp21(126-183)，ct618(199-241)，這12個(gè)區(qū)段進(jìn)行克隆表達(dá)，其氨基酸殘基如序列seq?id?no:13-24所示。

20、將獲得的這12個(gè)截短的免疫優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段抗原，分別進(jìn)行包被96孔板，elisa間接法檢測(cè)對(duì)感染者和正常人血清的反應(yīng)性。

21、經(jīng)過(guò)對(duì)比總結(jié)發(fā)現(xiàn)，12個(gè)截短的免疫優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段抗原，繼承了各自全長(zhǎng)蛋白的大部分靈敏度，但是特異性有較大提升，其中inca(323-378)，momp(209-267)，tarp(103-161)，ywbm(68-123)，pmp6(233-291)，53kda(290-340)這6個(gè)表位區(qū)段抗原特異性在95％以上，于是考慮將這6個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段進(jìn)行嵌合表達(dá)。

22、用基因操作手段，將inca(323-378)，momp(209-267)，tarp(103-161)，ywbm(68-123)，pmp6(233-291)，53kda(290-340)這6個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段連接到一個(gè)質(zhì)粒，串聯(lián)成pcdna-cpnchimer6克隆，隨后進(jìn)行類(lèi)似的轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染和純化操作，得到肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原cpnchimer6，隨后采用elisa間接法檢測(cè)對(duì)感染者和正常人血清的反應(yīng)性。

23、發(fā)明人驚喜地發(fā)現(xiàn)，這個(gè)肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原cpnchimer6內(nèi)部的6個(gè)抗原片段在之前單獨(dú)使用時(shí)，都只能檢出不到一半的陽(yáng)性血清，但是嵌合表達(dá)之后能夠檢出絕大多數(shù)的陽(yáng)性血清。將該肺炎衣原體重組多表位嵌合抗原cpnchimer6用于elisa平臺(tái)或者層析平臺(tái)檢測(cè)igg，檢測(cè)igm，雙抗原夾心法檢測(cè)總抗體，與對(duì)照產(chǎn)品相比都具有很好的靈敏度和特異性。

24、本發(fā)明的有益效果：采用肺炎衣原體多個(gè)不同蛋白的優(yōu)勢(shì)表位區(qū)嵌合表達(dá)，比單獨(dú)蛋白有更高靈敏度，并且與沙眼衣原體等其它物種的蛋白質(zhì)序列同源性很低，避免了交叉反應(yīng)引起的假陽(yáng)性。選取的區(qū)段親水性強(qiáng)，加上采用優(yōu)秀的融合蛋白sumo可以提升表達(dá)量和可溶性，整體蛋白可溶性好。不同肽段之間用連接肽進(jìn)行間隔，有利于ni柱親和層析純化，有利于各自表位的暴露并與抗體充分結(jié)合。采用hek表達(dá)系統(tǒng)，比合成肽或原核表達(dá)的抗原活性更佳。用于間接法檢測(cè)igg，捕獲法檢測(cè)igm，雙抗原夾心法檢測(cè)總抗體，同時(shí)可以用于層析法，簡(jiǎn)單快速抗體，整體靈敏度，特異性都好，不同檢測(cè)平臺(tái)統(tǒng)一通用。