本公開大體上涉及用于在細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器中對(duì)基底進(jìn)行涂布的系統(tǒng)和方法。具體地說，本公開涉及在灌注生物反應(yīng)器容器中對(duì)基底進(jìn)行原位涂布。
背景技術(shù)：
1、在生物加工行業(yè)中，大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞以用于生產(chǎn)激素、酶、抗體、疫苗和細(xì)胞療法。細(xì)胞和基因療法市場正在迅速增長，有前景的治療方法進(jìn)入臨床試驗(yàn)并迅速走向商業(yè)化。然而，一次細(xì)胞療法給藥可能需要數(shù)十億個(gè)細(xì)胞或數(shù)萬億個(gè)病毒。因此，能夠在短時(shí)間內(nèi)提供大量細(xì)胞產(chǎn)物對(duì)于臨床成功至關(guān)重要。
2、生物加工中使用的大部分細(xì)胞是貼壁依賴性的，這意味著細(xì)胞需要粘附于表面才能生長和發(fā)揮作用。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)在用于基因和修飾細(xì)胞療法的病毒載體的生產(chǎn)中占主導(dǎo)地位。這是因?yàn)橛糜诓《据d體生產(chǎn)的細(xì)胞主要是貼壁依賴性的。病毒載體通常用于將遺傳物質(zhì)遞送到細(xì)胞和組織中，使得可以校正遺傳缺陷、增強(qiáng)細(xì)胞和組織功能或改善細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn)，最終實(shí)現(xiàn)潛在的治愈性治療。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)在擴(kuò)大用于再生醫(yī)學(xué)的干細(xì)胞的規(guī)模方面也占主導(dǎo)地位。這是因?yàn)槔缯T導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)和間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)等干細(xì)胞在本質(zhì)上也是貼壁依賴性的。干細(xì)胞在細(xì)胞療法、組織工程和再生醫(yī)學(xué)以及制藥和生物技術(shù)應(yīng)用方面具有廣闊的前景。迫切需要可靠且高效的平臺(tái)來擴(kuò)大貼壁細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模。
3、用于生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)基底的材料有很多。這些材料中的一種是聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(pet)，其主要用于病毒載體和疫苗生產(chǎn)，但其在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的其它應(yīng)用中的作用有限。例如，許多現(xiàn)有的固定床生物反應(yīng)器尚未用于干細(xì)胞培養(yǎng)。因此，迫切需要開發(fā)一種具有功能化或涂布表面的固定床細(xì)胞培養(yǎng)基底，其能夠支持更廣泛的細(xì)胞類型的培養(yǎng)。
4、哺乳動(dòng)物細(xì)胞被用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)、單克隆抗體、病毒載體，以及甚至培養(yǎng)肉。此外，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中，數(shù)十億干細(xì)胞被用于制造組織工程構(gòu)建體，或用于補(bǔ)充退行性疾病中損失或受損的細(xì)胞。盡管懸浮細(xì)胞培養(yǎng)被廣泛用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)和抗體，但貼壁細(xì)胞培養(yǎng)在用于基因和修飾細(xì)胞療法的病毒載體以及用于再生醫(yī)學(xué)的干細(xì)胞的生產(chǎn)中占主導(dǎo)地位。通常使用病毒載體將遺傳物質(zhì)遞送到細(xì)胞和組織中，使得可以校正遺傳缺陷、增強(qiáng)細(xì)胞和組織功能或改善細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn)，最終實(shí)現(xiàn)潛在的治愈性治療。
5、干細(xì)胞在細(xì)胞療法、組織工程和再生醫(yī)學(xué)以及制藥和生物技術(shù)應(yīng)用方面具有廣闊的前景。然而，用于病毒載體生產(chǎn)的細(xì)胞主要是貼壁依賴性的；類似地，例如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)和間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)等干細(xì)胞在本質(zhì)上也是貼壁依賴性的。人多能干細(xì)胞(hpsc)，包含人胚胎干細(xì)胞(hesc)和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hipsc)，具有無限自我更新的能力，并且可以分化成三原胚層(three?primary?germ?layers)的所有衍生物。這些細(xì)胞在臨床應(yīng)用、再生醫(yī)學(xué)、組織工程、藥物篩選和早期發(fā)育生物學(xué)研究中具有巨大的潛力。細(xì)胞療法和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用需要大量的hpsc。這需要能夠高效擴(kuò)大hpsc規(guī)模和擴(kuò)增hpsc的技術(shù)。此外，對(duì)于細(xì)胞療法和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用，需要生產(chǎn)大量分化成特定譜系的細(xì)胞。這需要可以支持hpsc高效且有效分化的技術(shù)。
6、hpsc的培養(yǎng)需要受控的培養(yǎng)環(huán)境，以確保細(xì)胞的附著、存活、增殖、自我更新以及維持細(xì)胞的多能性和基因組穩(wěn)定性。人類psc是在天然來源的細(xì)胞外基質(zhì)(例如，基質(zhì)、life?technologies的)、重組蛋白(例如玻連蛋白(vitronectin)、層粘連蛋白-511(laminin-511)、層粘連蛋白-521)和合成表面上進(jìn)行培養(yǎng)。
7、需要一種細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)和使用此類系統(tǒng)的方法，其不僅允許培養(yǎng)終末分化的成體細(xì)胞，而且允許在生物反應(yīng)器中分化hpsc。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、根據(jù)實(shí)施例，提供了一種在生物反應(yīng)器系統(tǒng)中分化細(xì)胞的方法。所述方法包含：將干細(xì)胞接種在生物反應(yīng)器中，所述生物反應(yīng)器具有裝有細(xì)胞基底的細(xì)胞培養(yǎng)室；以及使用支持未分化干細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基來培養(yǎng)干細(xì)胞。所述方法進(jìn)一步包含向細(xì)胞培養(yǎng)室灌注分化培養(yǎng)基，以促進(jìn)干細(xì)胞分化成一個(gè)或多個(gè)譜系。所述方法進(jìn)一步包含在分化完成之后，用洗滌溶液洗滌細(xì)胞。洗滌溶液可以是流體介質(zhì)和/或磷酸鹽緩沖溶液(pbs)。所述方法可以進(jìn)一步包含在生物反應(yīng)器中對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行額外培養(yǎng)。任選地，所述方法還包含收獲分化細(xì)胞或細(xì)胞副產(chǎn)物。收獲可以包含向細(xì)胞培養(yǎng)室灌注解離試劑，以從生物反應(yīng)器中釋放和移出分化細(xì)胞。從生物反應(yīng)器中移出分化細(xì)胞還可以包含對(duì)生物反應(yīng)器加壓，以迫使分化細(xì)胞和任何培養(yǎng)基離開生物反應(yīng)器。
2、根據(jù)實(shí)施例，提供了一種在生物反應(yīng)器中對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基底進(jìn)行原位涂布的方法。所述方法包含提供生物反應(yīng)器容器，所述生物反應(yīng)器容器內(nèi)具有細(xì)胞培養(yǎng)室。細(xì)胞培養(yǎng)室包含用于使流體流入細(xì)胞培養(yǎng)室中的入口以及用于使流體從細(xì)胞培養(yǎng)室中流出的出口。所述生物反應(yīng)器容器還包含細(xì)胞基底，所述細(xì)胞基底設(shè)置在所述細(xì)胞培養(yǎng)室中，用于在所述細(xì)胞基底上培養(yǎng)細(xì)胞。所述方法包含：提供用于涂布細(xì)胞基底的涂布溶液；通過入口將涂布溶液輸入到細(xì)胞培養(yǎng)室中，使得涂布溶液接觸細(xì)胞基底以涂布細(xì)胞基底；以及經(jīng)由出口或入口從細(xì)胞培養(yǎng)室中去除多余的涂布溶液。在去除涂布溶液后，涂布后的細(xì)胞基底留在細(xì)胞培養(yǎng)室中。
3、根據(jù)實(shí)施例，提供了一種在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞的方法。所述方法包含在本文所描述的生物反應(yīng)器內(nèi)涂布細(xì)胞基底；將細(xì)胞接種在涂布后的細(xì)胞基底上；在涂布后的細(xì)胞基底上培養(yǎng)細(xì)胞；以及收獲細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物。
4、根據(jù)實(shí)施例，提供了一種在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包含生物反應(yīng)器容器，其具有所述生物反應(yīng)器容器內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)室。細(xì)胞培養(yǎng)室包含用于使流體流入細(xì)胞培養(yǎng)室中的入口以及用于使流體從細(xì)胞培養(yǎng)室中流出的出口。細(xì)胞培養(yǎng)基底還包含細(xì)胞基底，所述細(xì)胞基底設(shè)置在所述細(xì)胞培養(yǎng)室中，用于在所述細(xì)胞基底上培養(yǎng)細(xì)胞。還提供了再循環(huán)回路，其可以經(jīng)由入口將流體供應(yīng)到生物反應(yīng)器容器，并經(jīng)由出口從生物反應(yīng)器容器中移出流體。所述系統(tǒng)進(jìn)一步包含以流體方式連接到細(xì)胞培養(yǎng)室的涂布溶液容器，用于容納基底涂布溶液。
1.一種使用細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器在所述生物反應(yīng)器中原位分化干細(xì)胞的方法，所述方法包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括在向所述細(xì)胞培養(yǎng)室灌注所述分化培養(yǎng)基之后，向所述細(xì)胞培養(yǎng)室灌注解離試劑，所述解離試劑被配置成從所述細(xì)胞基底中釋放所述分化細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其進(jìn)一步包括收獲步驟，所述收獲步驟包括從所述細(xì)胞培養(yǎng)室中移出所述釋放的分化細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括在向所述生物反應(yīng)器灌注所述分化培養(yǎng)基之后，用洗滌溶液洗滌所述細(xì)胞培養(yǎng)室。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述洗滌溶液包括流體介質(zhì)或磷酸鹽緩沖溶液(pbs)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的方法，其進(jìn)一步包括在用洗滌溶液洗滌所述細(xì)胞培養(yǎng)室之后，向所述細(xì)胞培養(yǎng)室灌注解離試劑，所述解離試劑被配置成從所述細(xì)胞基底中釋放所述分化細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其進(jìn)一步包括收獲步驟，所述收獲步驟包括從所述細(xì)胞培養(yǎng)室中移出所述釋放的分化細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括：
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其進(jìn)一步包括經(jīng)由所述出口或所述入口從所述細(xì)胞培養(yǎng)室中去除多余的所述涂布溶液，其中，在去除所述涂布溶液后，涂布后的細(xì)胞基底留在所述細(xì)胞培養(yǎng)室中。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所述的方法，其進(jìn)一步包括在去除所述涂布溶液期間或之后，用洗滌溶液洗滌所述細(xì)胞培養(yǎng)室。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中提供所述涂布溶液包括制備適用于特定細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用或特定細(xì)胞類型的涂布溶液。
12.根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述涂布溶液包括用于增強(qiáng)所述細(xì)胞基底上的細(xì)胞附著和/或生長的材料。
13.根據(jù)權(quán)利要求8至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述涂布溶液包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白、水凝膠溶液、聚合物溶液和重組蛋白中的至少一種。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞基底包括第一側(cè)、與所述第一側(cè)相對(duì)的第二側(cè)、分離所述第一側(cè)與所述第二側(cè)的厚度，以及形成在所述細(xì)胞基底中并穿過所述細(xì)胞基底的所述厚度的多個(gè)開口。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞基底包括模塑聚合物網(wǎng)格片、3d打印網(wǎng)格片和編織網(wǎng)片中的至少一種。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞基底包括聚合物材料。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述聚合物材料是聚苯乙烯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚環(huán)氧乙烷、聚吡咯和聚環(huán)氧丙烷中的至少一種。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物反應(yīng)器被配置成實(shí)現(xiàn)流體均勻流過所述細(xì)胞基底和/或細(xì)胞培養(yǎng)室。
19.一種用于在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的系統(tǒng)，其中所述分化培養(yǎng)基容器經(jīng)由所述再循環(huán)回路以流體方式連接到所述細(xì)胞培養(yǎng)室。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括用于將未分化細(xì)胞輸入到所述細(xì)胞培養(yǎng)室中的細(xì)胞接種物源。
22.根據(jù)權(quán)利要求19至21中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括涂布溶液容器，所述涂布溶液容器以流體方式連接到所述細(xì)胞培養(yǎng)室并被配置成用于容納基底涂布溶液。
23.根據(jù)權(quán)利要求19至22中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)泵，所述一個(gè)或多個(gè)泵用于使細(xì)胞培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、洗滌溶液、解離試劑和細(xì)胞接種物中的至少一種循環(huán)通過所述再循環(huán)回路或進(jìn)入所述細(xì)胞培養(yǎng)室中。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括用于控制所述一個(gè)或多個(gè)泵的控制器。
25.根據(jù)權(quán)利要求所述24的系統(tǒng)，其中控制所述一個(gè)或多個(gè)泵包括控制所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的流體的流速或流動(dòng)方向。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或權(quán)利要求25所述的系統(tǒng)，其中所述控制器包括處理器和存儲(chǔ)器，所述存儲(chǔ)器含有指令并且與所述處理器通信并可由所述處理器讀取。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的系統(tǒng)，其中，當(dāng)所述處理器執(zhí)行所述指令時(shí)，所述控制器接收以下操作中的至少一個(gè)的信號(hào)：將所述未分化細(xì)胞注入所述細(xì)胞培養(yǎng)室中、將所述分化培養(yǎng)基注入所述細(xì)胞培養(yǎng)室中、將所述洗滌溶液注入所述細(xì)胞培養(yǎng)室中、將所述涂布溶液注入所述細(xì)胞培養(yǎng)室中、將細(xì)胞培養(yǎng)基注入所述細(xì)胞培養(yǎng)室中，以及將所述解離試劑注入所述細(xì)胞培養(yǎng)室中。