本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料，特別涉及一種不易塌陷的非金屬生物人工骨料及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、自然骨骨質(zhì)分為松質(zhì)骨和密質(zhì)骨，密質(zhì)骨將松質(zhì)骨包裹其中，其中，密質(zhì)骨約占人體骨骼重量的75%，孔隙率為5-30%；松質(zhì)骨約占人體骨骼重量的25%，孔隙率為30-90%。為了滿足仿生學(xué)要求，人工骨內(nèi)部結(jié)構(gòu)應(yīng)該有與自然骨相似的非均勻分布的梯度孔隙結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)的人工骨產(chǎn)品大多為均一結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，忽略了真實(shí)骨組織結(jié)構(gòu)實(shí)際同時(shí)包含密質(zhì)骨和松質(zhì)骨兩種形式，這導(dǎo)致人工骨支架材料的血管化水平、成骨性能和生物力學(xué)性能等無(wú)法較好滿足臨床骨修復(fù)。然而梯度人工骨的設(shè)計(jì)難度非常高。

2、專(zhuān)利號(hào)cn108261568b的專(zhuān)利公開(kāi)一種復(fù)合梯度骨修復(fù)材料及其制備方法，通過(guò)3d打印的方式獲得了均勻性和穩(wěn)定性較好的梯度支架骨修復(fù)材料。但該方法采取了高溫煅燒去除支架3d打印成型工藝中引入的pva成分，降低了材料的生物活性和成骨活性，且該支架材料只實(shí)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)仿生，無(wú)組成成分仿生。

3、cristian?parisi等人在i型膠原蛋白中分別加入不同含量的氫氧化鈣和磷酸，得到了不同重量比的四個(gè)梯度溶液，將四份溶液逐層加入模具，一步凍干成型后，依次進(jìn)行熱交聯(lián)和nhs/edc交聯(lián)，交聯(lián)后凍干。此種方法實(shí)現(xiàn)了梯度骨的結(jié)構(gòu)和組分的仿生。然而，對(duì)于這種先得到不同梯度溶液而后一次凍干的方法，處于液態(tài)的不同梯度的溶液在凍干前和凍干過(guò)程中，在自身重力作用下，液體是會(huì)擴(kuò)散的，造成四個(gè)梯度溶液一定程度的混勻，從而削減了這種梯度的變化。而為了降低前述的不同梯度溶液在重力作用下的混勻，則要求在最下層的一定是密度最大的物質(zhì)，整體材料從下向上保持密度減小的趨勢(shì)。此外，經(jīng)過(guò)實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，該研究中的梯度溶液雖具有一定的梯度結(jié)構(gòu)，但其孔隙率都非常大，但從孔隙率而言，其和自然骨的孔隙率分布具有較大差異，無(wú)法實(shí)現(xiàn)真正的仿生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服上述問(wèn)題，本發(fā)明第一方面提供了一種不易塌陷的非金屬生物人工骨料，所述非金屬生物人工骨料具有梯度的三層支架結(jié)構(gòu)，梯度的三層支架結(jié)構(gòu)包括第一支架層，第二支架層和第三支架層；第一支架層，第二支架層和第三支架層的層平均孔隙率的比為（0.9-1.7）：（1.4-3）：（0.9-1.7）。

2、具體的，第一支架層，第二支架層和第三支架層的層平均孔隙率的比為1：（1.4-3）：（0.9-1.4）。

3、具體的，第一支架層，第二支架層和第三支架層的層平均孔隙率的比為1：（1.4-3）：（0.9-1.3）。

4、具體的，第一支架層，第二支架層和第三支架層的層平均孔隙率的比為1：（1.4-2.3）：（0.9-1.3）。

5、具體的，第一支架層，第二支架層和第三支架層的層平均孔隙率的比為1：（1.8-2.3）：（0.9-1.3）。

6、具體的，第一支架層，第二支架層和第三支架層的層平均孔隙率的比為1：（1.4-2.3）：（0.9-1.2）。

7、具體的，第一支架層，第二支架層和第三支架層的層平均孔隙率的比為1：（1.4-2.3）：（0.9-1.1）。

8、具體的，第一支架層，第二支架層和第三支架層的層平均孔隙率的比為1：（1.8-2.3）：（0.9-1.1）。

9、具體的，第一支架層，第二支架層和第三支架層的層平均孔隙率的比為1：（1.4-2.3）：1。

10、在一些實(shí)施方案中，第一支架層的層平均孔隙率為30-50%，第二支架層的層平均孔隙率為70-90%，第三支架層的層平均孔隙率為30-50%。

11、具體的，第一支架層的層平均孔隙率為31-48%，第二支架層的層平均孔隙率為71-88%，第三支架層的層平均孔隙率為34-50%。

12、具體的，第一支架層的層平均孔隙率為31-47.8%，第二支架層的層平均孔隙率為71.4-87.5%，第三支架層的層平均孔隙率為34.1-49.2%。

13、在一些實(shí)施方案中，第一支架層和第三支架層的總質(zhì)量和第二支架層的質(zhì)量之比為（3.4-4.8）：1。

14、具體的，第一支架層和第三支架層的總質(zhì)量和第二支架層的質(zhì)量之比為（3.4-4.5）：1。

15、具體的，第一支架層和第三支架層的總質(zhì)量和第二支架層的質(zhì)量之比為（3.4-3.6）：1。

16、具體的，在一些實(shí)施方案中，第一支架層和第三支架層的質(zhì)量比為1:1，第一支架層和第三支架層的體積基本相等。

17、為了得到自然骨內(nèi)疏外密的相似結(jié)構(gòu)，發(fā)明人想要設(shè)計(jì)一種具有5-30%孔隙率的密質(zhì)骨包裹孔隙率為30-90%的松質(zhì)骨的人工骨料，在大量的思考和論證之后，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過(guò)控制非金屬生物人工骨料每支架層的孔隙率、質(zhì)量和體積，具體為第一支架層，第二支架層和第三支架層的層平均孔隙率的比為（0.9-1.7）：（1.4-3）：（0.9-1.7）；第一支架層的層平均孔隙率為30-50%，第二支架層的層平均孔隙率為70-90%，第三支架層的層平均孔隙率為30-50%；第一支架層和第三支架層的總質(zhì)量和第二支架層的質(zhì)量之比為（3.4-4.8）：1，不僅能夠得到想要的仿生結(jié)構(gòu)，而且所得材料的不易向骨缺損方向塌陷，從而具有良好的骨修復(fù)生長(zhǎng)效果，這可能是由于，當(dāng)人工骨料處于上述結(jié)構(gòu)下時(shí)，對(duì)鈣離子的分泌代謝起到了一定調(diào)節(jié)作用，同時(shí)，這種結(jié)構(gòu)有利于引導(dǎo)骨細(xì)胞的增值，從而使外界機(jī)械應(yīng)力得到平衡，有利于引導(dǎo)骨小梁有序排列。已知密質(zhì)骨約占人體骨骼重量的75%，松質(zhì)骨約占人體骨骼重量的25%，推測(cè)在進(jìn)行人工骨設(shè)計(jì)時(shí)，密質(zhì)骨和松質(zhì)骨的重量比為75：25，即3：1時(shí)較符合生物學(xué)仿生結(jié)構(gòu)。然而在本技術(shù)方案中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在第一支架層，第二支架層和第三支架層的層平均孔隙率的比為（0.9-1.7）：（1.4-3）：（0.9-1.7）；第一支架層的層平均孔隙率為30-50%，第二支架層的層平均孔隙率為70-90%，第三支架層的層平均孔隙率為30-50%的情況下，適當(dāng)增加密質(zhì)骨的重量，即第一支架層和第三支架層的總質(zhì)量和第二支架層的質(zhì)量之比為（3.4-4.8）：1，不僅具有良好的生物學(xué)穩(wěn)定性，而且還使得人工骨料在植入后能夠快速修復(fù)原有缺陷，有助于提升新生骨痂且增加其強(qiáng)度，猜測(cè)這可能是密質(zhì)骨的增加有利于成骨空間的穩(wěn)定，具有接近孔隙率的相同體積的同種材料的第一支架層和第三支架層的厚度接近，作用于骨缺損部位創(chuàng)傷處，對(duì)血凝塊的初始形成和黏附產(chǎn)生空間影響，同時(shí)血凝塊穩(wěn)定的表面應(yīng)力也反過(guò)來(lái)作用于骨，刺激骨細(xì)胞生長(zhǎng)，上述效果尤其滿足了骨修復(fù)早期臨床上的訴求，加快了骨修復(fù)初期的修復(fù)速度，并且新生骨的強(qiáng)度能持續(xù)保持穩(wěn)定，骨質(zhì)不易流失。

18、在一些實(shí)施方案中，非金屬生物人工骨料的制備方法為：

19、s1.經(jīng)過(guò)脫脂、洗出和抗原封閉的脫細(xì)胞基質(zhì)粉碎成脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒后，配成脫細(xì)胞基質(zhì)料液，備用；分別配置鈣鹽水溶液和磷酸鹽水溶液備用；

20、s2.調(diào)整鈣鹽水溶液中的鈣鹽、磷酸鹽水溶液中的磷酸鹽，以及脫細(xì)胞基質(zhì)料液的脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒的質(zhì)量比，將鈣鹽水溶液加入脫細(xì)胞基質(zhì)料液后，調(diào)整為ph=9-11，加入磷酸鹽水溶液，配置得到第一乳液；

21、s3.重復(fù)步驟s1，調(diào)整鈣鹽水溶液中的鈣鹽、磷酸鹽水溶液中的磷酸鹽，以及脫細(xì)胞基質(zhì)料液的脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒的質(zhì)量比，配置得到第二乳液；

22、s4.重復(fù)步驟s1，調(diào)整鈣鹽水溶液中的鈣鹽、磷酸鹽水溶液中的磷酸鹽，以及脫細(xì)胞基質(zhì)料液的脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒的質(zhì)量比，配置得到第三乳液；

23、s5.將第一乳液倒入模具中，進(jìn)行第一次凍干；繼續(xù)加入第二乳液，進(jìn)行第二次凍干；繼續(xù)加入第三乳液，進(jìn)行第三次凍干，得到前驅(qū)體；

24、s6.前驅(qū)體浸沒(méi)于交聯(lián)劑水溶液中交聯(lián)12-24h后，用去離子水沖洗，進(jìn)行第四次凍干；此時(shí)，由模具下部至模具上部，分別為第一支架層、第二支架層和第三支架層。

25、具體的，在步驟s1中，脫細(xì)胞基質(zhì)在脫脂、洗出和抗原封閉前，來(lái)源于豬、牛和人體的軟組織，包括皮膚、真皮、血管、膈膜、肌腱、韌帶、大腸、小腸和神經(jīng)組織；前述軟組織通過(guò)灌注-壓差法來(lái)脫脂、洗出和抗原封閉后獲得脫細(xì)胞基質(zhì)，灌注-壓差法的具體過(guò)程記載在專(zhuān)利號(hào)cn106075583b的專(zhuān)利文本。

26、步驟s1中，經(jīng)過(guò)脫脂、洗出和抗原封閉的脫細(xì)胞基質(zhì)通過(guò)物理粉碎成脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒后，加入0.4%胃蛋白酶水溶液，備用。

27、步驟s1中，分別配置鈣鹽水溶液和磷酸鹽水溶液備用，其中，鈣鹽選自硝酸鈣、乙酸鈣、氯化鈣、碳酸氫鈣或檸檬酸鈣中的一種或幾種；磷酸鹽選自磷酸氫二銨、磷酸氫二鉀或磷酸氫二鈉中的一種或幾種。

28、具體的，鈣鹽為乙酸鈣或氯化鈣。此時(shí)后續(xù)和磷酸鹽原位生成的羥基磷灰石具有棒狀或柱狀結(jié)構(gòu)，更有利于成骨空間的穩(wěn)定，進(jìn)一步保證人工骨料的穩(wěn)定強(qiáng)度。

29、磷酸鹽為磷酸氫二銨。

30、在一些實(shí)施方案中，第一乳液中，鈣鹽水溶液中的鈣鹽、磷酸鹽水溶液中的磷酸鹽，以及脫細(xì)胞基質(zhì)料液的脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒的質(zhì)量比為（7.89-16.81）：（3.44-7.51）：0.5；第三乳液中，鈣鹽水溶液中的鈣鹽、磷酸鹽水溶液中的磷酸鹽，以及脫細(xì)胞基質(zhì)料液的脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒的質(zhì)量比為（7.89-16.81）：（3.44-7.51）：0.5。

31、在一些實(shí)施方案中，第二乳液中，鈣鹽水溶液中的鈣鹽、磷酸鹽水溶液中的磷酸鹽，以及脫細(xì)胞基質(zhì)料液的脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒的質(zhì)量比為（1.62-2.63）：（0.73-1.18）：0.5。

32、在一些實(shí)施方案中，所述第一次凍干、第二次凍干、第三次凍干和第四次凍干均為階段性凍干，階段性凍干包括六個(gè)階段。

33、在一些實(shí)施方案中，階段性凍干的具體工藝條件為：

34、第一階段：-80℃--40℃，保溫3-10h；

35、第二階段：-40℃--20℃，保溫10-18h；

36、第三階段：-20℃--10℃，保溫12-18h；

37、第四階段：-10-0℃，保溫10-15h；

38、第五階段：0-20℃；保溫2-5h；

39、第六階段：20-30℃，保溫2-5h。

40、基于cristian?parisi等人的研究，發(fā)明人曾嘗試將第一乳液、第二乳液和第三乳液依次倒入模具中后一次凍干，其結(jié)果也正如背景技術(shù)中所述，處于液態(tài)的不同梯度的溶液在凍干前和凍干過(guò)程中，在自身重力作用下，液體擴(kuò)散，造成一定混勻，削減了梯度變化。于是，發(fā)明人初步嘗試分步凍干，結(jié)果并不理想，每支架層并不能很好的結(jié)合在一起，即每支架層很容易被剝離或分離開(kāi)來(lái)。最終，發(fā)明人通過(guò)鈣鹽水溶液中的鈣鹽、磷酸鹽水溶液中的磷酸鹽，以及脫細(xì)胞基質(zhì)料液的脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒的質(zhì)量比，即第一乳液中，鈣鹽水溶液中的鈣鹽、磷酸鹽水溶液中的磷酸鹽，以及脫細(xì)胞基質(zhì)料液的脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒的質(zhì)量比為（7.89-16.81）：（3.44-7.51）：0.5；第二乳液中，鈣鹽水溶液中的鈣鹽、磷酸鹽水溶液中的磷酸鹽，以及脫細(xì)胞基質(zhì)料液的脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒的質(zhì)量比為（1.62-2.63）：（0.73-1.18）：0.5；第三乳液中，鈣鹽水溶液中的鈣鹽、磷酸鹽水溶液中的磷酸鹽，以及脫細(xì)胞基質(zhì)料液的脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒的質(zhì)量比為（7.89-16.81）：（3.44-7.51）：0.5；結(jié)合特定的階段性凍干，影響局部晶核受到擠壓形成的速度，形成特定冰晶形態(tài)，平衡了產(chǎn)品纖維結(jié)構(gòu)的完整性，同時(shí)結(jié)合升溫后已形成的羥基磷灰石的吸濕性，克服了支架層易分離的問(wèn)題，不僅是提高三層支架的界面結(jié)合性能，防止修復(fù)過(guò)程中出現(xiàn)材料分層的問(wèn)題，更重要的是，通過(guò)提高層-層間的剝離強(qiáng)度，以此提高操作手感，使得材料更易用于植入。

41、具體的，步驟s6中，交聯(lián)劑為1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺（edc）或戊二醛，交聯(lián)劑水溶液的濃度為0.1-1mol/l。

42、本發(fā)明第二方面提供了一種不易塌陷的非金屬生物人工骨料在制備牙齒修復(fù)材料、頜骨修復(fù)材料、脊柱修復(fù)材料、關(guān)節(jié)修復(fù)材料、骨盆修復(fù)材料的應(yīng)用。

43、有益效果：（1）本發(fā)明所得的非金屬生物人工骨料利用自組裝技術(shù)，以ecm中膠原分子為模板，加入含鈣離子溶液和含磷酸根離子的溶液，在分子模板上原位礦化生長(zhǎng)羥基磷灰石。其礦化成核的羥基磷灰石和ecm結(jié)合后，與天然骨組織有相近的結(jié)構(gòu)，有利于人體細(xì)胞及大分子對(duì)其識(shí)別，提高了材料植入體內(nèi)后的生物活性。（2）模擬自然骨密質(zhì)骨與松質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)和組成，實(shí)現(xiàn)支架材料結(jié)構(gòu)、成分和功能仿生，這種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)使支架材料植入體內(nèi)后能夠較好的吸收應(yīng)力，提高材料生物力學(xué)性能。同時(shí)也有利于細(xì)胞滲透和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送，顯著提高成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖速度，以及加速血管化水平和支架材料向活體骨轉(zhuǎn)換的速度。（3）與其他人工合成磷酸鈣人工骨、同種異體骨或異種骨（尤其是脫鈣骨基質(zhì)dbm）相比，本發(fā)明所得的非金屬生物人工骨料能夠更好的吸附內(nèi)源性生長(zhǎng)因子，提高成骨活性。（4）通過(guò)控制第一支架層，第二支架層和第三支架層的層平均孔隙率的比為（0.9-1.7）：（1.4-3）：（0.9-1.7）；第一支架層的層平均孔隙率為30-50%，第二支架層的層平均孔隙率為70-90%，第三支架層的層平均孔隙率為30-50%的情況下，適當(dāng)增加密質(zhì)骨的重量，即第一支架層和第三支架層的總質(zhì)量和第二支架層的質(zhì)量之比為（3.4-4.8）：1，不僅具有良好的生物學(xué)穩(wěn)定性，而且還使得人工骨料在植入后能夠快速修復(fù)原有缺陷，有助于提升新生骨痂且增加其強(qiáng)度，加快骨修復(fù)初期的修復(fù)速度，并且新生骨的強(qiáng)度能持續(xù)保持穩(wěn)定，骨質(zhì)不易流失，尤其滿足了骨修復(fù)早期臨床上的訴求。（5）控制第一乳液中，鈣鹽水溶液中的鈣鹽、磷酸鹽水溶液中的磷酸鹽，以及脫細(xì)胞基質(zhì)料液的脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒的質(zhì)量比為（7.89-16.81）：（3.44-7.51）：0.5；第二乳液中，鈣鹽水溶液中的鈣鹽、磷酸鹽水溶液中的磷酸鹽，以及脫細(xì)胞基質(zhì)料液的脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒的質(zhì)量比為（1.62-2.63）：（0.73-1.18）：0.5；第三乳液中，鈣鹽水溶液中的鈣鹽、磷酸鹽水溶液中的磷酸鹽，以及脫細(xì)胞基質(zhì)料液的脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒的質(zhì)量比為（7.89-16.81）：（3.44-7.51）：0.5；結(jié)合特定的階段性凍干（即分別進(jìn)行3次凍干后再一起交聯(lián)后進(jìn)行第4次凍干，并且每次凍干包括六個(gè)階段，每個(gè)階段設(shè)置特定的溫度范圍），不僅是提高三層支架的界面結(jié)合性能，避免修復(fù)過(guò)程中出現(xiàn)材料分層的問(wèn)題，更重要的是，通過(guò)顯著提高層-層間的剝離強(qiáng)度，以此提高操作手感，使得材料更易用于植入，在操作時(shí)可以任意角度植入而保證產(chǎn)品不發(fā)生分層。